培养基组分对茵芋花粉萌发和花粉管生长的影响

郑天汉

（福建省林业局，福州350003）

茵芋（Skimmiareevesiana），又称黄山桂，具有治疗风湿痹痛、四肢挛急、两足软弱等药用价值，也是观叶、观花、观果俱佳植物。张琪等［1］从成分、药理、临床应用等方面探讨了茵芋的药用价值；郑天汉等［2］利用电镜手段观测了茵芋的生物学特征；张洪杰等［3］分析了多脉茵芋（Skimmiamultinervia）的化学成分；郑天汉等［4］开展了不同基质与激素对茵芋扦插萌芽效应的研究。由于茵芋生长在海拔1 400—2 400 m的野生环境条件下，繁殖较困难，原生种质资源稀少，因此通过人工辅助授粉方法提高茵芋的授粉、结实率具有现实意义。目前，有关培养基组分对茵芋花粉离体萌发影响的研究未见报道。本试验对不同培养基中茵芋花粉的萌发和花粉管生长情况进行研究，分析其增殖条件，以期为茵芋人工辅助授粉、种质基因保存、异地授粉和杂交育种等提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用的茵芋花粉材料来自生长健壮、无病虫害的3年生盆栽茵芋雄株，生长于福建省洋口国有林场，平均冠幅23 cm，平均株高28 cm。于2016年3月22日即茵芋盛花期采集材料。选取饱满刚开裂但未散粉或即将开裂散粉的花药，用镊子夹起花药囊，用解剖针刺破，抖落散出花粉，将花粉收集于载玻片上备用。

利用三因素（A代表蔗糖、B代表硼酸、C代表氯化钙）三水平（分别用1、2、3表示）设置不同的培养基进行花粉萌发的离体培养试验，试验方案见表1。根据方案配制27个组合的培养基，放入花粉并用解剖针搅拌均匀，培养基中含0.7%（W/V）琼脂，pH为5.8—6.0，置于载玻片上，转入25℃恒温暗条件下进行花粉萌发培养［7-8］，每4 h检测一次，连续检测24 h。

表1 花粉离体培养试验方案Table 1 Test scheme of pollen culture in vitro g·L-1

1.2 花粉萌发情况的显微观察

每处理随机选取5个载有花粉的载玻片置于IBE2000型倒置生物荧光显示镜下，每个视野花粉总数要大于30粒，观测花粉管生长情况并拍照。花粉萌发标准为花粉管长度超过花粉粒直径。在光学显微镜下用测微尺测量花粉管长度，统计各处理的花粉萌发率和花粉管长度。花粉萌发率＝萌发的花粉粒数/视野中花粉粒总数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对茵芋花粉管生长的影响

各处理的茵芋花粉管总平均长度为 252.9μm。其中，A1、A2、A3处理的平均花粉管长度分别是172.2μm、302.9μm、284.4μm，B1、B2、B3处理的平均花粉管长度分别是 263.2μm、254.6μm、239.8μm，C1、C2、C3处理的平均花粉管长度分别是 279.6μm、287.4μm、192.4μm，即蔗糖处理的平均花粉管长度为253.2μm，硼酸处理的平均花粉管长度为252.5μm，氯化钙处理的平均花粉管长度为253.1μm。A2的平均花粉管长度是A1的1.76倍，B1是B3的1.10倍，C2是C3的1.49倍，说明不同浓度的蔗糖、氯化钙对茵芋花粉管生长影响较大，而不同浓度的硼酸影响较小。

方差分析表明，A、B、C单因素条件下的不同浓度水平对茵芋花粉管长度的影响极显著（表2）。不同浓度蔗糖对茵芋花粉管长度效应表现为A2＞A3＞A1，说明10 g/L和15 g/L的蔗糖对花粉管生长促进效应明显；不同浓度硼酸对茵芋花粉管长度效应表现为B1＞B2＞B3，说明花粉管长度随硼酸浓度降低而增长；不同浓度氯化钙对茵芋花粉管长度效应表现为C2＞C1＞C3，即0.02 g/L的氯化钙最有利于花粉管生长，0.03 g/L的氯化钙则最不利。

表2 花粉管生长的多因素互作效应方差分析Table 2 Variance analysis ofmulti factor interaction effects on pollen tube grow th

2.2 不同培养基与浓度水平对茵芋花粉管生长的交互效应

由图1可知，A×B×C构成的27种培养基对茵芋花粉管长度的影响表现为A3B1C2＞A3B2C2＞A2B3C2＞A2B2C2＞A3B1C1＞A2B2C1＞A3B3C1＞A2B1C3＞A2B1C1＞A2B1C2＞A2B3C3＞A3B3C2＞A3B2C1＞A1B1C1＞A2B2C3＞A2B3C1＞A1B3C1＞A1B2C1＞A3B2C3＞A3B3C3＞A1B2C2＞A1B3C2＞A1B1C2＞A3B1C3＞A1B2C3＞A1B1C3＞A1B3C3。A3B1C2组合最有利于促进花粉管生长，其花粉管长度是最不利培养基的4.3倍，表明蔗糖、硼酸、氯化钙及其浓度对茵芋花粉管长度具有明显的影响。

图1 A、B、C互作效应的花粉管长度Fig.1 Pollen tube length of A，B，C interaction effect

由表2可知，A×B×C对茵芋花粉管长度的互作效应差异显著，A×C互作效应差异极显著，A×B和B×C的互作效应差异不显著。为进一步分析各因素及其浓度水平的互作效应来源，分别对蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平组合进行分组分析。

由图2可知，A1、A2、A3分别与B构成的3个组合，各组内的花粉管长度基本一致，结合上述蔗糖单因素分析结果A2＞A3＞A1，说明组间的花粉管长度差异是来源于不同的蔗糖浓度，由此可以认为B因素及其浓度对花粉管长度基本没有影响。

由图3可知，A1、A2、A3分别与C构成的3个组合，在组内和组间都有明显效应，结合上述氯化钙单因素分析结果C2＞C1＞C3，说明A×C具有明显组合效应，其中A2C2和A3C2对茵芋花粉管生长的促进作用最明显。

图2 A、B互作的花粉管长度Fig.2 Pollen tube length of A，B interaction

图3 A、C互作的花粉管长度Fig.3 Pollen tube length of A，C interaction

由图4可知，B×C构成的组合，在组内由C3即较高浓度的氯化钙引发差异，但在组间差异小，结合上述氯化钙单因素分析结果B1＞B2＞B3，说明B×C组合对茵芋花粉管生长没有实际意义。同时，由图3和图4可见，C3即较高浓度的氯化钙对茵芋花粉管生长具有抑制作用。

图4 B、C互作的花粉管长度Fig.4 Pollen tube length of B，C interaction

2.3 不同培养基对茵芋花粉萌发率的影响

各处理组中，A1、A2、A3处理的平均萌发率分别是33.3%、41.1%、41.9%，B1、B2、B3处理的平均萌发率分别是34.4%、40.8%、41.2%，C1、C2、C3处理的平均萌发率分别是38.4%、45.6%、32.4%。试验所采用的3种蔗糖浓度对茵芋花粉萌发率效应表现为A3＞A2＞A1，即茵芋花粉萌发率随着蔗糖浓度增加而提高，而且A3、A2的萌发率分别比A1高25.8%、23.4%，A3的萌发率仅比A2高2.0%，说明5 g/L蔗糖偏低，10 g/L蔗糖可作为培养基合理浓度。试验所采用的3种氯化钙浓度对茵芋花粉萌发率效应表现为C2＞C1＞C3，即0.02 g/L氯化钙促进茵芋花粉萌发作用最好，0.03 g/L氯化钙则抑制了茵芋花粉萌发。前人研究表明［10］，细胞中98%的硼主要位于细胞壁，以酯化果胶形式存在，而在花粉管中，酯化果胶集中在花粉管顶端，使顶端存在一定的延展性以利于延伸生长，而酸性果胶遍及整个花粉管，使细胞壁有足够的机械强度。一般情况下，花粉中硼是不足的，植物在自然授粉时由雌花柱头和花柱内的硼补偿，在花粉离体状态下，适宜浓度的硼处理能有效提高花粉的萌芽率。试验所采用的3种硼酸浓度对茵芋花粉萌发率效应表现为B3＞B2＞B1，即茵芋花粉萌发率随着硼酸浓度的增加而提高，B3、B2的萌发率分别比B1高20.0%、18.6%，B3比B2高1.0%，说明0.01 g/L硼酸偏低，0.03 g/L硼酸可作为培养基合理浓度。

2.4 不同培养基组合下茵芋花粉萌发率、花粉管长度的相关分析

A×B组合与A×C组合的茵芋花粉萌发率相关系数为0.1834，差异不显著；A×B组合与B×C组合的萌发率相关系数为0.7599，差异显著；A×C组合与B×C组合的萌发率相关系数为0.2239，差异不显著。相关分析结果说明，3种组合类型对茵芋花粉萌发率的影响具有一致性，结合上述的萌发率效应比较，表明3种组合均对茵芋花粉萌发有促进作用。

A×B组合与A×C组合的茵芋花粉管长度相关系数为0.8081，差异显著；A×B组合与B×C组合的花粉管长度相关系数为-0.0219，差异不显著；A×C组合与B×C组合的花粉管长度相关系数为0.4076，差异不显著。相关分析表明，A×B组合与A×C组合对茵芋花粉管生长差异显著，其他两种组合则不具一致性。

萌发率与花粉管长度在A×B×C三因素构成的27个组合的测定值相关系数为0.5812，具有显著水平，说明蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平交互作用在茵芋花粉萌发率和花粉管长度之间具有较高的一致性。观察花粉管生长过程，发现花粉管生长具有明显趋向培养基营养液的效应，说明蔗糖、硼酸、氯化钙对茵芋花粉萌发和花粉管生长两方面都发挥了作用。

由表3可见，A×B的萌发率与A×B、A×C、B×C的花粉管长度之间的相关系数分别为0.6659、0.9979、0.9987，呈正相关；其中，A×B的萌发率与A×B的花粉管长度的相关性不显著，A×B的萌发率与A×C、B×C的花粉管长度的相关性表现为极显著正相关；说明A×B的萌发率与A×B、A×C、B×C的花粉管生长都具有一致性，其中A×B的萌发率与A×C、B×C的花粉管生长具有极显著共同趋向。A×C的萌发率与A×B、A×C、B×C的花粉管长度的相关系数分别为0.3812、-0.3911、-0.1238，二者之间均表现为不显著的正相关或负相关。B×C的萌发率与A×B、A×C、B×C的花粉管长度之间表现为不显著的负相关。说明不同组合之间对茵芋花粉萌发率和花粉管生长的影响均具有不一致的效应，负相关说明有利于花粉萌发却抑制花粉管生长，反之亦然。

表3 萌发率与花粉管长度在组合间的相关分析Table 3 Correlation analysis between germ ination rate and pollen tube length in combination

3 结论

本试验表明，不同浓度的蔗糖、硼酸、氯化钙对茵芋花粉管长度有显著影响。具体为各因素在水平之间差异明显，其中不同浓度的蔗糖、氯化钙对茵芋花粉管生长影响较大，不同浓度的硼酸影响较小；三因素及其水平之间的交互效应明显，A3B1C2组合的花粉管最长（398.8μm），A3B2C2组合次之（364.4μm）；最优培养基A3B1C2的花粉管长度是最差培养基A1B3C3（92.8μm）的4.3倍，是最优单因素培养基（A2）花粉管长度的1.32倍，是最优双因素培养基（A3C2）花粉管长度的1.14倍，表明蔗糖、硼酸、氯化钙三因素组合对茵芋花粉管长度的影响十分明显。综合分析培养基组分对茵芋花粉管生长影响的主次作用，表现为氯化钙发挥主因素作用，硼酸发挥次因素作用，蔗糖发挥辅助作用。

蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平互作下，对茵芋花粉萌发率和花粉管生长的影响效应具有较强一致性，蔗糖、硼酸、氯化钙对于茵芋花粉萌发和花粉管生长两方面都发挥了作用。A×B、A×C、B×C的双因素组合中，对茵芋花粉萌发率的影响具有一致性，对茵芋花粉管生长的影响则不具一致性。

致谢：阮伟伦院士对茵芋课题研究技术方案给予指导，何国生教授、黄青山高工、华伟平讲师参与茵芋野外种质调查与材料提取，阮淑明副教授参与茵芋花粉萌发试验，特此感谢！