地毯草铝响应基因AcABCG1的克隆与表达分析

2019-11-07李季肤韩佳芮贾怡丹张郎织王文强王志勇陈志坚

草地学报 2019年5期

李季肤，韩佳芮，贾怡丹，张郎织，王文强，王志勇*，陈志坚,*

(1. 热带特色林木花卉遗传与种质创新教育部重点实验室/海南大学林学院，海南海口 570228；2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南海口 571101)

铝(Aluminum，Al)是地壳中分布最广、含量最丰富的金属元素，其通常以难溶性硅酸盐或氧化铝的形式存在[1]。当土壤pH低于5.0时，铝以Al3+离子形式存在，Al3+离子会对植物细胞产生毒害[2]。铝对植物的毒害表现在抑制DNA的复制和转录、破坏细胞骨架和影响钙离子通道等方面，进而阻碍了细胞分裂和抑制根系的伸长，进一步影响根系对水分和养分的吸收[3]。因此，铝毒害是酸性土壤中限制作物生长和产量的重要因素之一[4]。为适应酸铝胁迫，植物形成了外部解铝毒和内部忍耐两方面耐铝机制。通过根系分泌有机酸(如苹果酸，柠檬酸和草酸等)，与根际铝离子螯合，从而阻止Al3+进入细胞被认为是植物外部解铝毒机制[5]。内部忍耐机制包括把细胞中的铝离子隔离在液泡、质外体和细胞壁中缓解铝毒害；增强细胞的抗氧化胁迫能力在植物耐铝毒害中也发挥着重要作用[6]。

地毯草(Axonopuscompressus)是禾本科地毯草属多年生草本植物，可用于公共绿地，控制水土流失和路边草坪等方面，又因其秆叶柔嫩，可作为优质牧草[7]。地毯草起源于美国南部及热带美洲，广泛分布于热带和亚热带地区，也是我国热带地区重要的热带暖季型草坪草之一[8]。通过对铝胁迫下地毯草、钝叶草(Stenotaohrumsecundatum)、结缕草(Zoysiajaponica)、假检草(Eremochloaophiuroides)和狗牙根(Cynodondactylon)等常见暖季型草坪草生长和元素分析发现，地毯草具有较高的生物量和养分吸收能力，暗示了地毯草具有较强的耐铝毒能力[9]。然而，迄今为止，国内外主要对地毯草耐铝能力进行评价分析[10-11]，对地毯草响应铝及耐铝毒机制仍不清楚，并且，地毯草铝响应基因仍未见有相关报道。

ABC(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白是1个大家族蛋白，其能够借助水解ATP释放的能量完成底物的跨膜运输[12]。因其丰富的底物选择性，ABC转运蛋白在生物体内参与多种重要生理过程。ABCG转运蛋白属于ABC家族中的1个亚家族成员，ABCG转运蛋白包含核苷酸结合域(Nucleotide-binding domain，NBD)和跨膜结构域(Transme-brane domain，TMD)[13]。其中，亲水性NBD结构域能够结合水解ATP，为跨膜运输提供能量[14]，而疏水性TMD结构域由4-6个跨膜α螺旋构成，形成跨膜通道，并能够特异识别底物[15]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和烟草(Nicotianatabacum)等植物中，相继报道了ABCG转运蛋白的功能。例如，在拟南芥中，AtABCG40参与ABA的吸收以及重金属铅(Pb)的转运，对植物响应金属胁迫具有重要作用[16]。此外，AtABCG14参与拟南芥根部细胞分裂素向地上部的运输[17]，而AtABCG36参与了生长素的运输[18]。因此，ABCG转运蛋白在植物器官发育、激素运输和抵抗重金属胁迫等方面起重要作用。本研究以地毯草为实验材料，克隆获得了地毯草ABC转运蛋白基因AcABCG1，并对AcABCG1基因进行了生物信息学和基因表达模式分析，为研究地毯草适应铝毒胁迫机制提供候选基因资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用实验材料为地毯草野生种质“A58”[10]，采集于广东广州，现保存于海南大学林学院。

1.2 实验方法

1.2.1材料培养与处理参考张静等[11]方法进行地毯草预培养。挑选生长一致的地毯草匍匐茎，在1/2 Hoagland营养液中预培养7 d。随后，选取根长5 cm左右的幼苗，在光照培养箱中进行铝处理。实验设置4个不同铝浓度处理，分别为0(CK)，50，100，200 μM AlCl3(pH 4.2)，铝处理时间为24 h。另外，在100 μM AlCl3(pH 4.2)浓度下，设置不同铝时间处理，分别为0，12，24 h。每个处理设置4个生物学重复。分别在铝处理前、后，用根系扫描仪(EPSON，日本)扫描植株根长图片。

1.2.2相对根长测定参考罗佳佳等[19]方法进行相对根长测定。使用Image J(National Institutes of Health，美国)软件统计根长。将铝处理前的根长记录为RLAl0h或RLCK0h，铝处理后记录为RLAlnh或RLCK0h。根据公式(RLAlnh-RLAl0h)/(RLCKnh-RLCK0h)×100%计算相对根长。

1.2.3总RNA提取和cDNA合成参考TRNzol Universal总RNA提取试剂(TIANGEN，中国)说明书提取地毯草总RNA。取0.1 g植物样品，加入0.7 mL TRNzol提取液，充分研磨后，室温放置5 min后，4℃，10 000 rpm离心3 min。吸取上清液，并加入5 M NaCl和氯仿，充分混匀，4℃，13 000 rpm离心10 min。吸取上清，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置10 min后，4℃，13 000 rpm离心10 min。弃上清，加入1 mL 75%乙醇，4℃，5 000 rpm离心3 min。弃上清，风干沉淀，加入无RNase水，充分溶解RNA。参考RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒(Thermo Fisher，美国)方法合成cDNA第一链。在PCR管中加入2 μg RNA、1 μL Oligo (dT)18，并加入Water nuclease-free至12 μL。于65℃反应5 min后，加入4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL dNTP Mix，1 μL RiboLock RNase Inhibitor和 1 μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase。于42℃反应60 min，70℃反应5 min。反应结束后，样品于—20℃保存备用。

1.2.4AcABCG1基因克隆根据地毯草根系铝响应转录组结果，筛选获得AcABCG1基因全长序列；利用Oligo7设计上游引物AcABCG1-F和下游引物AcABCG1-R(表1)；以根系cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，与pMD18-T载体(TaKaRa，日本)连接，转化大肠杆菌后，经菌液PCR筛选阳性克隆并进行测序分析，获得AcABCG1全长cDNA序列，并将序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，基因序列号为MN310539。

1.2.5生物信息学分析采用EXPASY在线网站分析蛋白的二级(https://web.expasy.org/protparam)，釆用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)在线网站进行跨膜结构域分析；采用WoLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)在线软件进行基因的亚细胞定位预测；采用NCBI网站进行保守结构域分析；采用MEME在线软件(http://meme-suite.org)进行蛋白Motif分析；运用DNAMAN进行多序列比对分析；采用MEGA 7软件进行系统进化树分析。

1.2.6荧光定量PCR分析使用QuantStudioTMReal-Time PCR(Thermo Fisher，美国)系统和SYBR Green(Vazyme，中国)定量试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。实时荧光定量PCR反应体系(20 μL)为：10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，6 μL dd H2O，1 μL引物(10 μM)，2 μL稀释60倍的cDNA模板。反应程序为：95℃ 1 min，95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40次循环。AcABCG1基因相对表达量=目的基因(AcABCG1)表达量/内参基因(AcEF-1a)表达量。内参基因AcEF-1a的NCBI序列号为MN310540。AcABCG1和AcEF-1a定量PCR引物如表1所示。

表1 AcABCG1基因克隆和定量PCR引物

1.3 数据统计分析

实验数据通过Microsoft Excel 2003进行平均数、标准误计算和图表绘制，采用SPSS数据分析软件(IBM SPSS Statistics 20)进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同铝浓度处理对地毯草根系生长的影响

本研究首先分析了不同铝浓度处理对地毯草根系生长的影响。从(图1A)可以看出，铝处理显著抑制地毯草根伸长，但不同铝浓度处理抑制的程度不一样，铝浓度越高，相对根长受抑制程度越大。在50，100，200 μM铝处理24 h下，地毯草相对根伸长分别为60.8%，47.4%和32.4%(图1B)。结果表明铝毒显著抑制地毯草根系生长。

2.2 AcABCG1的克隆和保守结构域分析

根据转录组测序结果获得的AcABCG1基因序列，设计正向和反向引物，以铝处理下地毯草根系cDNA为模板，扩增出AcABCG1基因cDNA全长序列，基因大小为2 434 bp(图2)，并且，经测序分析发现AcABCG1基因全长序列与转录组结果一致。利用ExPASyProt软件分析发现AcABCG1基因编码811个氨基酸残基，蛋白分子量为91.85 kD，理论等电点为8.83，为亲水性蛋白。CDD Tools预测表明，AcABCG1属于ABCG亚家族成员，AcABCG1蛋白含有ABC转运蛋白的保守序列，即核苷酸结合结构域和跨膜结构域特征序列(图3)。

图1 铝处理对地毯草根生长的影响

图2 AcABCG1全长cDNA的克隆

2.3 AcABCG1蛋白理化性质分析

利用TMHMM Server V2.0 软件对AcABCG1蛋白跨膜结构域进行分析，结果表明该蛋白包含6个跨膜结构域(图4)。SignalP 5.0 server软件分析显示，该基因不存在信号肽构，表明该蛋白不是分泌蛋白。利用WoLF PSORT预测分析发现，AcABCG1蛋白定位于细胞膜上，暗示该蛋白为膜蛋白。

2.4 系统进化树分析

从系统进化树可以看出，ABCGs蛋白可以被分为I、II、III和IV共4类群(图5)。其中，地毯草AcABCG1蛋白属于第II类群，与拟南芥AtABCG7，AtABCG41，AtABCG18，AtABCG29和AtABCG38，以及水稻OsABCG15，OsABCG26和OsABCG43等同属1个分支，同源性最高。

图3 AcABCG1保守结构域分析

图4 AcABCG1蛋白跨膜结构域分析

2.5 不同处理对AcABCG1基因表达的影响

本研究进一步分析了pH、100 μM铝(Al)、40 μM镉(Cd)和20 μM镧(La)处理对AcABCG1基因表达的影响。从图6A可以看出，相对pH5.8对照处理，Al,Cd和La处理均显著增强了AcABCG1基因在地毯草根系中的表达，且AcABCG1基因在Al处理条件下的表达量最高，Cd处理次之。然而，低pH(pH4.2)对AcABCG1基因表达影响不明显。

从图6B可以看出，随着Al处理浓度增加，AcABCG1基因表达量呈现先增加后下降的趋势。并且，AcABCG1的表达量在100 μM铝处理下达到最大，是对照(0 μM Al)处理下的3.5倍(图6B)。类似的，随Al处理时间的延长，AcABCG1基因表达量逐渐增加，且在铝处理48 h条件下表达量最高(图6C)。

2.6 AcABCG1基因组织表达分析

本研究进一步分析了AcABCG1基因在地毯草不同组织中的表达模式。从图7A可以看出，地毯草AcABCG1基因在根中的表达量最高，茎次之，叶部最低。此外，AcABCG1基因主要在0～1 cm根尖中表达，其次为1～2 cm根部，而AcABCG1在大于3 cm的根中表达量最低，仅为0～1 cm根尖的1.2%(图7B)。

3 讨论与结论

铝毒害破坏植物根尖的结构，抑制根系生长[21-22]。铝毒抑制根系生长因不同植物或基因型有所差异，并且，热带和亚热带地区的植物经过长期的进化，对酸性土壤铝毒形成了较强的适应性[23]。研究发现，在铝处理下，相对钝叶草、结缕草、假检草、狗牙根、海滨雀稗(Seashorepaspalum)和马尼拉草(Zoysiamatrella)等草坪草，地毯草具有最高的根生物量，暗示了地毯草具有较强的耐铝能力[16]。然而，不同地毯草的耐铝能力具有基因型差异，其中，地毯草A58为耐铝基因型[17]。因此，本研究以铝处理下的地毯草“A58”为材料，克隆了地毯草根系铝响应AcABCG1基因(图2)。

ABC转运蛋白是1个庞大的蛋白家族，在拟南芥、水稻和烟草等植物中已克隆并鉴定出多个ABC转运蛋白家族成员[8]。ABCG属于ABC蛋白家族成员。在拟南芥中，具有43个ABCG；在水稻中，具有40个ABCG；而在烟草中，具有134个ABCG[24-26]。ABCG转运蛋白包含NBD结合域和TMD结构域；依据NBD和TMD的组成，可将ABCG转运蛋白家族分为两类。一类是WBC型，其结构为NBD-TMD，称为半分子转运蛋白。另一类为PDR型，结构为NBD-TMD-NBD-TMD，称为全分子转运蛋白[27]。在本研究中，经预测地毯草AcABCG1蛋白具有ABCG转运蛋白的保守结构域，结构为NBD-TMD，为半分子转运蛋白(图3，4)。结果表明地毯草AcABCG1蛋白特性和结构特征均具备与其他植物ABCGs的相似特点。

图7 地毯草AcABCG1基因组织表达分析

系统进化树分析表明，地毯草AcABCG1蛋白属于第II类群，与拟南芥AtABCG7，AtABCG41，AtABCG18，AtABCG29和AtABCG38，以及水稻OsABCG26，OsABCG15和OsABCG43同源性最高(图5)。与地毯草AcABCG1同源的ABCG蛋白在调控植物激素和金属离子转运中具有重要作用。例如，金属Cd处理增强了OsABCG43在水稻根中的表达，并且，超表达OsABCG43基因能够增强酵母细胞的耐Cd能力，暗示了OsABCG43基因可能参与了水稻镉离子的转运，把Cd积累在根部的细胞器(如液泡)中，从而缓解金属Cd毒害[28]。本研究发现，地毯草AcABCG1蛋白具有典型的ABCG蛋白结构特点，并与上述蛋白具有较高的同源性，暗示了地毯草AcABCG1可能具有转运金属铝离子的功能。

对地毯草AcABCG1基因表达分析发现金属处理均显著增强了AcABCG1基因在根系中的表达，其中，AcABCG1基因在Al处理下的表达量最高，表明了AcABCG1基因在转录水平上能响应铝毒胁迫(图6)。类似的，研究发现OsABCG43主要在水稻根系中表达，并且，金属Cd处理增强了OsABCG43在水稻根中的表达，暗示其可能与根系Cd离子的转运相关[28]；此外，金属Pb处理增强了拟南芥AtABCG40/AtPDR12在根和茎中的表达，并且，超表达该基因能增强植株的耐Pb能力[29]。因此，以上结果暗示了地毯草AcABCG1基因可能具有转运铝离子的功能，但其生物学功能仍需做进一步研究。