香根草对镉毒害的生理响应——采用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)

余顺慧,张 静,陈华华,张 波,胡超生,邓洪平

1 重庆三峡学院,三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室, 万州 404100 2 重庆市万州区生态环境监测站, 万州 404100 3 重庆市交通规划勘察设计院,重庆 401121 4西南大学生命科学学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400715

工业排污,农业耕作等生产活动造成的土壤重金属污染问题日益严重。目前,我国重金属污染土壤总面积已达2×107hm2,占我国耕地总面积的1/5[1]。其中,重金属镉(Cd)是毒性最强的元素之一,易溶于水、通过食物链,对人体健康构成巨大威胁。如何去除土壤中的重金属Cd已成为人们关注的热点。传统的物理、化学修复方法存在成本高、破坏土壤理化性质、易造成二次污染等弊端。植物修复(Phytoremediation) 是利用植物来转移、容纳或转化重金属污染物使其对环境无害的技术,具有成本低,不破坏生态环境等优点。这已经成为土壤、水体重金属污染研究领域的一项新兴技术。

高水平的重金属污染能引起植物细胞结构的伤害甚至致死。但在重金属胁迫早期,当胁迫没有产生生理症状时,在细胞和组织内的主要物质如蛋白质、糖含量、构象和分子内相互作用等方面都会发生变化,而这些变化一般通过测定可溶性糖、可溶性蛋白质含量及SOD、POD和CAT酶的活性等指标来进行研究。但测定这些生理指标的方法不但操作复杂、试剂花费较多,而且不能解析蛋白质等大分子物质结构上的变化[2]。傅立叶变换红外光谱(FTIR)是一种基于化合物中官能团和极性键振动的结构分析技术[3],其特点是操作简单、快速及灵敏度高。目前国内学者已经应用FTIR技术研究植物对重金属的耐性机制[4- 6]。薛生国等采用FTIR法探讨紫茉莉对Pb胁迫生理响应的影响,发现紫茉莉通过根系有机物含量的变化,将植物吸收的Pb 大部分积累在根部,阻止Pb向地上部分运输,有效的保护了植物地上部分[7]。付川等应用FTIR技术研究紫花苜蓿对Cu胁迫生理响应,认为植物化学组分的变化有助于揭示超富集植物的Cu耐性机理[8]。但国内外研究多集中在生物量小,根系不够发达的植物类群[9]。香根草(Vetiveriazizanioides) 为禾本科多年生草本植物,是三峡库区的原生物种,具有生物量大、根系发达、抗逆性强等特点,并且对重金属铅、镉具有较强的耐性和富集能力,可作为三峡库区土壤重金属污染修复的备选植物[10]。由此,探讨不同Cd处理条件下其化学组成上的变化将有利于揭示其耐Cd机制。本研究拟利用FTIR技术,探讨不同Cd处理条件下,香根草根、茎、叶的化学组分变化和毒害机理,为三峡库区重金属Cd污染防治和土壤植物修复提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 试验材料及方法

本研究以重庆三峡学院百安校区实验区的香根草为试验对象。2016年5 月随机选取健壮的、生长较为一致的香根草分蘖苗。先用水洗净,后移栽到含有Hoagland完全培养液的200 mL锥形瓶中进行水培纯化7 d。当新芽长出后,将植株移入含有不同Cd2+浓度(0、1.0、3.0、5.0、7.0 mg/L)的营养液中进行继续培养。Cd2+以3CdSO4·8H2O形式加入,每个浓度处理设3瓶。每3 d换一次培养液,24 h连续通气,所有处理培养液的pH值维持在(6.5±0.1)。若瓶内液体量减少,则滴加含Cd2+营养液至初始刻度线；若瓶内液体变浑浊,则更换带有Cd2+的营养液。处理10 d后收获香根草植株。用自来水和去离子水洗净,再分成两部分,一部分取叶保存于液氮中备用,用于测定植株亚细胞组分。另一部分分别取根、茎、叶3部分于105 ℃烘箱杀青30 min,然后于80 ℃烘箱烘中干燥48 h,用钢磨碎机研磨成粉末,过200目筛。用于测定植株根、茎、叶样品的光谱信息。

1.2 傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

来自于植物各部分的干粉用KBr混合(比例1.5∶100)。用傅里叶红外光谱仪(日本岛津制造IRPrestige-21,光谱范围4000—400 cm-1,分辨率16 cm-1)测定香根草根、茎、叶样品的光谱信息。

1.3 Cd2+亚细胞分布的测定

提取各细胞器和细胞质组分参照汤恵华等[11]方法。取嫩叶2.000 g,按1∶10的比例,加入预冷的匀浆液〔250 mmol/L蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),1 mmol/L二硫赤藓糖醇(C4H10O2S2)〕在4 ℃下研磨成匀浆。匀浆液先后在798 r/min离心10 min,1336 r/min离心15 min,13361 r/min离心20 min,先后得沉淀为细胞壁、叶绿体、线粒体组分,最后上清液为细胞质组分(含液泡及核糖和蛋白质等)。各组分供Cd2+含量测定。

1.4 微波消解样品测定其重金属Cd2+含量

精确称取各样品0.2000 g,加入酸液(浓HNO3∶浓H2SO4=4∶1),同时做空白组；将以上溶液在MARS240微波消解系统消解后,冷却。过滤,滤液在25 mL容量瓶中定容,移入塑料瓶中保存,用AA- 6300原子吸收分光光度计测定样品中Cd2+含量(mg/kg干重)[12]。

1.5 计算和数据分析

富集系数 (BF)= 植物地上或地下部分镉含量/营养液中镉含量

(1)

转运系数(TF)= 植物地上部分镉含量/根中镉含量

(2)

实验数据采用IBM SPSS 20进行统计分析和处理,并应用Origin 8.0 进行红外光谱数据图谱处理。

2 结果与讨论

2.1 Cd2+ 胁迫对香根草重金属分布的影响

与对照相比,随着Cd2+浓度的增大,香根草地下部分、地上部分Cd2+的含量逐渐增加；Cd2+处理后香根草的地下部分Cd2+含量明显大于地上部分(表1)。当用最高Cd2+浓度7 mg/L处理时,此时香根草出现受害症状,表现为幼苗矮化,根长、根体积减小等。按照李东旭等[13]提出的参考值,超富集植物的转运系数和富集系数都大于1。本实验香根草的转运系数和富集系数都小于1,说明香根草不属于超富集植物。但香根草生物量大、根系发达、抗逆性强。且具有较强的Cd耐性,可长时间适应低浓度Cd 胁迫,甚至是短时间的高浓度Cd胁迫[14]。香根草能吸收Cd 并储存在体内,具有较强的稳定能力,在Cd 污染土壤的修复方面有一定应用潜力[1],香根草作为一种植物修复的候选物种。

表1 Cd2+胁迫对香根草植物体内的积累和分布情况

Table 1 Accumulation and distribution of cadmium inV.zizanioidestissues and translocation factor in cadmium-treated solutions for 10 days

Cd2+的处理Treatment of cadmium地上部分Shoots/mg/kg地下部分Roots/mg/kgCdBFCdBFTFCk1.60±0.02e-4.93±0.12e-0.32t130.39±0.24d0.8635.18±0.13d0.830.28t265.51±0.25c0.91108.91±0.30c0.400.60t3119.03±0.35b0.75255.68±0.47b0.320.47t4212.49±0.71a0.58290.59±0.98a0.640.73

同列具有不同字母上标者为差异显著(P<0.05); Ck: 对照 (0 mg/L); t1: 1 mg/L; t2: 3 mg/L; t3: 5 mg/L; t4: 7 mg/L; Cd: 镉;BF:富集系数;TF: 转运系数

2.2 Cd2+ 在香根草叶片内的亚细胞分布

Cd2+在香根草叶片内的亚细胞组分间分布不均匀,其中分配比例最高的是在细胞质,细胞壁次之,含量最少的是在叶绿体和线粒体(表2)。随着Cd2+浓度的增高,叶片Cd2+总含量及各组分含量增加。当Cd2+浓度<3 mg/L时,Cd2+在细胞壁和细胞质中的分配比随Cd2+处理浓度升高而升高,而当Cd2+浓度>3 mg/L时,Cd2+在细胞壁中的分配比例随Cd2+处理浓度增高而降低,在细胞质中Cd2+的分配比例升高幅度也渐渐减少。可能是细胞质贮存Cd2+的能力有限。

表2 Cd2+在香根草叶片的亚细胞分布

1)同列具有不同字母上标者为差异显著(P<0.05);2)在括号里的数据为分配比例(%)

研究重金属的亚细胞分布是为了确定该元素对细胞活动的影响[12]。本试验中,细胞质是Cd2+主要贮存部位。细胞质包含液泡、细胞液、蛋白质等成分,大量贮存在香根草细胞质中的Cd2+是否被隔离在液泡中,以减少其毒性,提高香根草对Cd2+的耐受性,还有待进一步研究。细胞壁是重金属进入细胞内部的第一道屏障,细胞壁中的糖、蛋白质及有机酸等可与金属离子结合而贮存部分重金属,减少重金属对植物的毒害[12],这与后面FTIR研究中根、茎一致。Cd2+在叶绿体和线粒体含量最少,降低了Cd2+与有生命活性的原生质部分的接触机会,使酶的活性不受影响,保证了光合作用和呼吸作用的正常进行,这可能是香根草对Cd2+具有一定耐受性的原因[15]。

2.3 不同浓度Cd2+处理对香根草根、茎和叶的FTIR分析

图1 Cd2+处理下香根草根、茎、叶的红外光谱图Fig.1 Fourier Transform Infrared spectra of root, stem, leaf of V. zizanioides by cadmium treatment Ck: 对照 (0 mg/L); t1: 1 mg/L; t2: 3 mg/L; t3: 5 mg/L; t4: 7 mg/L

2.4 香根草特征峰吸光度变化的定量分析

对不同浓度重金属处理前后的香根草幼苗的根、茎、叶进行了红外光谱分析, 结果显示各组分在重金属处理前后的峰形基本保持不变。

由香根草的特征峰吸光度变化图2可见,香根草幼苗根、茎、叶红外光谱特征峰的吸收强度随Cd2+浓度的升高而表现出不同的趋势。根的特征峰吸光度变化为先降后升(见图2)。在3380—3429 cm-1,2920—2927 cm-1,1631—1645 cm-1,1395—1415 cm-1,1030—1064 cm-1等处,香根草幼苗根在Cd2+浓度低于3.0 mg/L时,该峰的吸光度下降,可能根外表皮细胞壁的羟基吸附结合Cd2+形成稳定的化合物,使细胞表面的羟基减少[7]、植物根系不断分泌有机酸螯合Cd2+,致使羧酸谱带下降、蛋白质二级结构中,肽键间氢键的结合力随着Cd2+浓度的升高而变弱、细胞壁通过降低果胶甲基化程度,使CEC(阳离子交换能力)提高,从而吸收更多的Cd2+,即通过细胞壁中积累Cd2+来增强抗逆性等。当Cd2+浓度大于3.0 mg/L时,峰值又呈上升趋势,原因是高浓度的Cd2+可能破坏了根外表皮细胞壁的羟基吸附结合Cd2+的机制,导致根外表皮细胞壁的羟基无法结合Cd2+,随着Cd2+对香根草毒害的进一步加重,其羧酸螯合力变弱,频带开始上升、此外不断增加的Cd2+诱导富脯氨酸蛋白、病害相关蛋白和富甘氨酸蛋白等一些蛋白合成[7],Didierjean等[20]还认为这些重金属胁迫诱导蛋白可能具有保护植物细胞免受重金属毒害的作用,出现的显著吸收峰可能与香根草根中氨基酸、多肽和蛋白质类物质含量升高等有关[7]。

香根草茎的特征峰吸光度变化为先升后降趋势(图2)。在低浓度时,所有香根草茎的特征峰吸光度随着Cd2+浓度的升高,先升高(图2),原因是低Cd2+下促进了有机物如纤维素、半纤维素、多糖等的分泌和运输及氨基酸、多肽和蛋白质等物质的产生,通过渗透调节来增强抗逆性,而在低浓度Cd2+刺激下,对峰值变化的主要贡献是膜脂过氧化作用,随着Cd2+浓度的升高,膜过氧化程度加深,脂肪族酮类化合物(过氧化产物)在根部积累,引起峰值升高,当Cd2+浓度大于3.0 mg/L时,吸光度下降,表明随着Cd2+毒的加剧,碳水化合物等物质的合成和运输都降低、蛋白质二级结构中肽键间氢键的结合力受影响较大。

香根草叶的特征峰吸光度变化也是先升后降趋势(图2)。由图2看出,在低Cd2+浓度时,所有香根草叶的特征峰吸光度随着Cd2+浓度的增加而上升,先上升的原因是低Cd2+刺激下促进了碳水化合物及有机物的分泌和运输,通过渗透作用来加强叶对Cd2+的抗逆性 、由根系输送来的羧酸盐较多,并以该形式积累在叶片和叶中蛋白质、氨基酸和多肽类物质含量增加。当Cd2+浓度大于3.0 mg/L时,吸光度降低,表明随着Cd2+毒的加剧,Cd2+阻碍了这些碳水化合物、有机物及叶中蛋白质、氨基酸和多肽类物质的合成和运输、根系羧酸螯合力变弱,其羧酸盐的运输能力也变弱等,曲线下降。

图2 Cd2+处理下香根草根、茎、叶的特征峰吸光度变化图Fig.2 The band height changes of root, stem and leaf in V. zizanioides by cadmium treatment 1030—1064 cm-1: 醇、酯基、醚基或酚类等化合物的C—O键的伸缩振动吸收峰;1395—1415 cm-1:甲基的吸收带;1631—1645 cm-1: N—H酰胺的弯曲振动峰;2920—2927 cm-1:羧酸O—H与甲基饱和C—H键的伸缩振动重叠峰;3380—3429 cm-1:分子间氢键O—H自由羟基的伸缩振动峰

3 结论

(1)香根草根组织在2927 cm-1处峰高先下降后上升,表明在低Cd2+(Cd2+<3 mg/L)处理条件下香根草分泌的有机酸不断螯合Cd2+,造成羧酸O—H的减少,但随着Cd2+含量的升高,其羧酸螯合力变弱,有机酸含量渐渐升高。

(2)香根草茎组织在1631 cm-1峰高处先上升后下降,表明在低Cd2+(Cd2+<3 mg/L)处理条件下香根草产生氨基酸、多肽和蛋白质等物质,通过渗透调节来增强抗逆性,但随着Cd2+含量的升高,蛋白质二级结构中肽键间氢键的结合力受影响较大

(3)香根草叶片富集的Cd2+主要分布于细胞质中,其次为细胞壁,而在线粒体和叶绿体中含量最低。

(4)虽然香根草对Cd2+的积累还未到达超富集植物的范围,但从耐Cd2+能力、地上部分对Cd2+的富集量、高生物量、生长快等多方面综合考虑,香根草在遭受Cd2+污染的土壤中植物修复技术领域,拥有潜在的利用价值。

致谢：东南大学王大勇教授对写作给予帮助,特此致谢。