柱后补偿电雾式液相色谱仪测定黄芪甲苷含量

沈建伟，李天才，周党卫，王环

（1.青海省藏药药理学和安全性评价研究重点实验室，青海西宁 810008；2.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810008）

黄芪甲苷是从豆科植物黄芪（Astragalus membranaceus Bunge）根中提取到的一种活性化合物，有“超级黄芪多糖”之称，具有增强机体免疫力、提高机体抗病能力等功效。黄芪甲苷在紫外区仅有弱的末端吸收，也无荧光发射特性，采用低波长紫外检测时干扰较大[1]。黄芪甲苷是黄芪药材中的主要功效成分，《中华人民共和国药典》2015年版一部黄芪含量测定项下，采用蒸发光散射检测器检测黄芪药材中黄芪甲苷含量[2]。电雾式检测器（Charged Aerosol Detection， CAD）是近些年发展起来的更加精密的通用型液相色谱检测器，更加适合紫外吸收弱的化合物含量检测。CAD的基本工作原理为：液相洗脱液首先在氮气的作用下雾化形成液滴，其中较大的液滴在碰撞器作用下经废液管流出，较小的溶质液滴在干燥管中干燥，溶剂和挥发性物质被蒸发，形成溶质气溶胶微小颗粒。同时，分流形成的第二股氮气经过含高压铂金丝电极的电晕式装置形成带正电荷的氮气流，与溶质气溶胶颗粒迎面相遇，经碰撞使溶脂颗粒带上正电荷。含溶质颗粒的气流随后通过带有低负电压直流电的离子阱装置，在电场作用下，迁移率较大，颗粒粒度较小的氮气吸附在直流电阴极，电荷被中和，随后迁移率小的带电颗粒把它们的电荷转移给颗粒收集器，最后用一个高灵敏度的静电检测计测出带电溶质的信号电流。由此产生的信号电流与溶质含量呈比例关系[3]。与蒸发光散射检测器相比，电雾式检测器具有更高的检测灵敏度及稳定性。为进一步减小溶剂干扰及基线漂移，本研究拟通过分离色谱柱之后增加溶剂补偿、柱温控制及雾化温度控制，优化出食品及中药中黄芪甲苷检测的更理想检测方法，以期对黄芪甲苷的质量控制提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙腈，山东禹王实业有限公司生产，色谱纯；甲醇，山东禹王实业有限公司生产，色谱纯；去离子水，美国Millipore公司净水机提供；高纯氮气，纯度99.999%，兰州裕隆气体股份有限公司生产；黄芪甲苷标准物质，中检所，批号110781，纯度≥98%。

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪（3000RS三元梯度泵，TCC-3000SD柱温箱，Corona Ultra电雾式检测器）及Dionex ISO-3100SD等度泵。

1.2 储备溶液及工作溶液配制

称取干燥后的黄芪甲苷标准品5.42 mg，加入甲醇溶解并精确定容至10.0 mL，即得0.542 mg/mL黄芪甲苷储备液；用移液管精确吸取2.0 mL黄芪甲苷储备液，再精确吸取2.0 mL甲醇，充分混匀，即得0.271 mg/mL黄芪甲苷工作溶液。

1.3 仪器分析条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流动相3000RS三元梯度泵（泵1）的流动相A（水）∶流动相B（乙腈）（V/V）=65∶35，流速1.0 mL/min。泵2（ISO-3100SD）的流动相为色谱乙腈，通过三通导入并与色谱柱分离得到的洗脱液混合均匀后进入电雾式检测器，从而实现溶剂补偿。

电雾式检测器参数设置：采集频率10 Hz；雾化器压力35.0 psi。

1.4 试验方法

在进样相同体积工作液时，通过控制试验不同的溶剂补偿体积、不同的柱温箱温度、不同的雾化温度。泵2（ISO-3100SD）补偿流速设置的0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 5个梯度；柱温箱温度分别设置为室温、30 ℃两个处理；雾化温度分别设置25 ℃及30 ℃两个处理，记录检测器记录的检测物电信号积分及高度。

2 结果与分析

2.1 补偿溶剂流速对信号相应的影响

在色谱柱柱温为室温、雾化温度25 ℃条件下，液相色谱每次进样黄芪甲苷标准工作液（0.271 mg/mL）20 μL。补偿溶剂流速对信号的影响如图1所示。由图1可以看出，随着溶剂补偿的增加，黄芪甲苷色谱保留时间在逐渐增加，积分面积也在相应增加。

由上到下依次为：未补偿、0.2 mL/min、0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min乙腈黄芪甲苷的色谱积分、峰高及信噪比如表1所示。

表1 不同补偿体积对响应信号的影响

由表1可以看出，在补偿流速小于0.8 mL/min时，积分面积随着有机溶剂补偿流速的增加而增大，积分面积及峰高在0.8 mL/min时达到最高，为23.972 1 pA·min及70.35 pA；补偿溶剂流速为1.0 mL/min时，积分面积减小，这可能与溶剂补偿引起的稀释效应有关；在0.2 mL/min及0.4 mL/min补偿条件下，黄芪甲苷积分面积增加较快，而0.6 mL/min及0.8 mL/min补偿条件下，积分面积增加值逐渐减小。同时可以看出，信噪比在补偿流速为0.6 mL时达到最大，为111.6。因此，从节约试剂及减小成本角度出发，认为有机溶剂补偿流速为0.4 mL/min即可实现色谱峰面积变大，色谱峰变高，检测器灵敏度提高的目的。

图1 溶剂补偿对黄芪甲苷色谱峰的影响

2.2 柱温箱温度对信号强度的影响

在0.4 mL/min有机溶剂补偿及30 ℃雾化条件下，研究柱温箱在30 ℃及35 ℃对色谱信号的影响，具体数值如表2所示。

由表2可以看出，柱温箱温度的升高对积分面积及峰高影响不明显；但随着柱温升高，信噪比增加，基线信号更加稳定，灵敏度升高。

2.3 雾化温度对信号响应的影响

在0.4 mL/min有机溶剂补偿及30 ℃柱温箱加热条件下，研究雾化温度在25 ℃、30 ℃及35 ℃条件下对色谱响应的影响，具体数值如表3所示。

表2 柱温箱温度对信号相应的影响

表3 雾化温度对信号相应的影响

由表3可以看出，在柱温为30 ℃条件下，雾化温度的升高对积分面积及峰高的影响并不明显，但同时雾化温度升高使得信噪比减小，其中的原因有待进一步研究。

3 结论

本实验对柱后补偿电雾式液相色谱仪测定黄芪甲苷含量从溶剂补偿流速、柱温箱温度、雾化温度三维度，在相同进样量、相同流动相组成及流速的条件下进行了系统研究。通过积分面积、峰高、信噪比三个指标综合评判，最终确定黄芪甲苷溶剂补偿电雾式液相色谱仪的最佳色谱条件为：0.4 mL/min乙腈补偿，柱温箱温度30 ℃，雾化温度30 ℃。本研究的实验结果可用于采用电雾式检测器测定黄芪甲苷含量的测定。