猪圆环三型病毒抗原蛋白表达体系的优化探究

吴凡，梅啸，吴凤亭

（苏州工业园区服务外包职业学院，江苏苏州 215123）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是一种共价闭合、单股环状DNA病毒。2015年，从美国北卡罗来纳州某猪场爆发的PDNS疫情中鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于70%，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为PCV3[1-2]。该病毒能引起猪的多系统炎症反应，若没有有效地控制方法，会对养猪产业带来灾难性的经济损失，同时对人类健康也有潜在风险[3-4]。因此针对这种新型PCV3病毒，疫苗的研究工作尤为重要。本实验作为相关疫苗研究工作的基础，主要对PCV3病毒进行序列优化后建立表达载体，对抗原蛋白发酵表达的条件进行探索，希望能够找到最优发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

氯化钠、氨水、盐酸为国药分析纯，自配；蛋白胨、酵母浸粉，购自安琪酵母股份有限公司；无水乙醇，购自Macklin公司。

1.1.2 实验对象

基因序列优化后的PCV3病毒。

1.1.3 主要设备

高速离心机（Thermo Scientific）、细胞均质机（AVESTIN）、高压灭菌锅（上海博迅）、凝胶成像仪（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 基因序列优化及表达载体构建

将PCV3基因序列的N端截去4个氨基酸达到最优序列，通过BamH1与Nco1两个酶切位点把优化后的PCV3序列构建到带有his标签的pET28b载体上。

1.2.2 摇瓶培养表达目的蛋白

（1）细胞转化。BL21细胞复苏后，加入pET28b-PCV3质粒进行转染，再加入500μL普通培养基培养1 h后，离心1 min，吸取上清液，离心管内沉淀加入BufferZ重悬，菌液涂抹在含有kan（卡那霉素）抗性的平板上，37℃过夜培养。

（2）摇瓶表达。从平板上挑取单克隆菌落放入100mL单抗（kan）培养基，稀释混匀后吸取10mL的菌液放入含有500mL的LB培养基和500μL的kan培养基的摇瓶中，分为三组，每组8个摇瓶。每组培养条件如表1。

表1 各组摇瓶表达条件

培养过程中，在加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG之前先检测菌液浑浊度（OD600值），达到要求后，每组按照表1加入IPTG诱导剂，按照各组摇菌条件培养过夜，让细菌充分进行蛋白表达后，利用破碎机将菌液破碎离心，弃去上清液，沉淀用Buffer Z重悬，放置在冰箱备用。

（3）发酵罐罐内灭菌镜检后，加入种子液与卡那霉素、加氯霉素发酵后，设置罐内培养参数，培养过程中，每过一小时监测一次OD600的值，诱导12 h。

1.2.3 发酵罐培养表达目的蛋白

（1）种子液准备。将转化好的细菌接种在含有卡那霉素 ＆ 氯霉素双抗平板上培养，37℃恒温培养24 h，挑取单菌落接种在含有5mL的双抗LB培养基中，37℃、250r/min摇床条件下，培养5～6h，作为一级种子液。再从一级种子液中吸取20μL培养基加入500mL的双抗培养基中，37℃、220r/min条件下培养过夜。

（2）发酵罐准备。发酵罐使用前罐内灭菌镜检，合格后按1∶4（磷酸∶氨水）的比例配制1000mL的溶液，在超净台上分装入小发酵罐，同时每个发酵罐内加入1‰的卡那霉素 ＆ 氯霉素；罐内通气量设为4m3/h，保持罐内正压，200r/min搅拌速度，温度37℃，打开蠕动泵，pH调至6.95～7.05。

（3）接种。种子液混匀加入发酵罐，发酵条件稳定在通气量4m3/h，罐压0.04～0.05MPa，转速200r/min。数值稳定10min后标定溶氧电极，做好标记。当OD600值达到20～25时，降温至28℃，温度稳定后30 min，快速加入IPTG（罐内溶液体积的1‰），灭菌密封，诱导12 h。期间监测OD600数据，观测罐内气泡及酸碱值。

1.2.4 细菌破碎纯化

将摇瓶表达的菌液与发酵菌液分别取出并进行细胞破碎，依次通过Q柱、Butyl柱纯化，用不同浓度的洗脱液洗脱杂蛋白，分别收集洗脱后的样品以备后期电泳。

1.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳验证表达蛋白量

配好胶后，将每组样品加入适量LoadingBuffer，点样后将胶体放入电泳槽，220V电压下跑胶30 min左右。

2 结果与分析

本实验需要关注的3种表达蛋白分别为52kD、49kD和41kD大小，根据诱导剂加入量不同、OD600值不同分为以下3种情况。

2.1 OD600为0.6、IPTG500μL条件下

如图1所示，不同洗脱条件下洗出的蛋白和杂蛋白大小及数量各不相同，在条带8、9中，在洗脱液为100%0.5mol/LNaCl imidazole的条件下，目标蛋白52kD、41kD和49kD处有明显的蛋白表达，49kD的表达量相对较高，但两条条带中，3种蛋白表达量并不均一，分子量大的表达量也较大。

图1 PCV3蛋白表达结果（OD600值0.6、IPTG500μL条件下）

2.2 OD600值为1.0、IPTG500μL条件下

如图2所示，3% 0.5mol/LNaCl imidazole洗脱液中已有目标蛋白的表达，但同时杂蛋白也较多，无法区分；在100%洗脱（条带5、6）时，3种表达蛋白有更明确的表达，杂蛋白表达量减少，并且在同等条件下，条带6上样量较多，3种蛋白表达量也增多。与第1组相比，改变菌液浊度（OD600从0.6提高到1.0）后3种蛋白都有较均一的表达量，但整体3种蛋白的表达量没有第1组高。

2.3 OD600值为1.0、IPTG100μL条件下

在本组条件中，菌液浊度不变，诱导剂IPTG加入的量减少到100μL，41kD、49kD与52kD3种蛋白表达量相较于前两个条件有所增加，同样在100%洗脱条件下的跑胶图显示的3种蛋白表达浓度最清晰，相互之间的表达量也较为均一，洗脱的杂蛋白的量减少，如图3所示。

图2 PCV3蛋白表达结果（OD600值1.0、IPTG500μL条件下）

图3 PCV3表达蛋白结果（OD600值1.0、IPTG100μL条件下）

2.4 发酵罐菌液跑胶图

图4可见，上样量为5μL的条带相较于上样量为2μL的条带在同样大小的蛋白处表达更高，在41kD、49kD和52kD3种蛋白大小处，条带1和5表达均一，浓度较低；条带2、3、4表达的蛋白浓度更高，均一度依然保持一致。

图4 发酵罐菌液跑胶表达图

3 结论

通过本实验中的摇瓶表达条件改变，发现在不同的菌液浑浊度下，加入不同量的IPTG都会影响到最后PCV3抗原蛋白的表达，当OD600为1.0、加入IPTG溶液100μL时，PCV3病毒蛋白表达量相对最高，表达效果也最均一。以往认为在OD600为1.0、IPTG溶液加入500μL时蛋白的表达量是较好的，但经过本次探究发现，IPTG溶液的加入量为100μL时，PCV3病毒蛋白的表达反而更多。

目前的PCV3疫苗还处于研究阶段，经过不断尝试但还达不到很好的效果，对PCV3病毒蛋白的表达大多是用摇瓶和小发酵罐进行生产研究，本研究提供了在优化的条件下快速安全的进行PCV3病毒蛋白的大量表达，为PCV3病毒疫苗的研究提供更好的基础。