高效液相色谱法测定不同品种石榴皮中5种类黄酮的含量

孟新涛，魏 健，许铭强，李德华，谭 归，朱丽娜，邵文志，潘 俨

(1.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所， 乌鲁木齐 830091；2.新疆主要农副产品精深加工工程技术研究中心，乌鲁木齐 830091 3.喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什 844006；4.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】石榴(PunicagranatumL.)属石榴科(Punicaceae)石榴属(PunicaL.)植物，是一种集生态、经济、社会效益、观赏价值与保健功能于一身的优良果树，具有极高的营养价值[1-2]及医用保健功能[3]。新疆石榴主要分布在喀什、和田、阿克苏及克孜勒苏州等地区，主要品种有皮亚曼、千籽红、赛柠檬和叶城石榴等[4-5]，占石榴果实总重量的11%～21%的石榴皮，在生产中食用与加工时被丢弃，造成严重的浪费[2]。目前，我区石榴深加工企业较少，分析不同品种石榴果皮中类黄酮物质的组分及含量，对新疆石榴类黄酮物质的良种选育和综合开发利用有实际意义。【前人研究进展】类黄酮是黄酮类化合物的简称，是一类三元环色素的总称[6-7]，是人类膳食摄入不可缺少的组成部分[8-10]，对人体有多种生理功能且不良反应少，是一类安全可靠、成本低、来源广的营养物质，有较大的开发和应用前景[11，12]。研究表明，石榴中富含类黄酮物质，其果实提取物对心脑血管疾病、细菌感染等具有显著的防治作用[13-14]。测定分析方法主要包括分光光度法、毛细管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法等[15-18]。高效液相色谱法(HPLC)作为一种简单、高效、快速的检测方法已被广泛应用[15-18]。目前，黄酮类成分的含量测定方法多以芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、异鼠李素为测定对象，但用槲皮素、山奈酚、异鼠李素中其中一种的量换算成总黄酮的量并不能准确反应提取物总黄酮的含量；因此建立石榴皮提取物中5种黄酮类成分(芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素)的同时测定方法具有重要意义[18]。【本研究切入点】国内外学者关于石榴中的类黄酮研究开展较早，但研究主要集中在石榴汁、石榴花、石榴叶等类黄酮物质的定性分析和总量测定等方面，且大多局限于某一单一品种研究。研究新疆石榴皮中5种类黄酮物质的测定方法。【拟解决的关键问题】以4个不同石榴品种为试材，采用高效液相色谱法(HPLC)提取和测定，石榴果皮中芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素)的含量比较分析4个不同品种石榴果皮中类黄酮物质的组分及含量差异，为新疆石榴类黄酮物质的开发利用和良种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

千籽红石榴采集于新疆喀什市；皮亚曼石榴、赛柠檬石榴采集于新疆和田市皮山县；叶城石榴采集于喀什市叶城县；采集时间均为2015年10月；芦丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、异鼠李素(纯度≥98%)所有标准品为HPLC级，北京世纪奥科生物技术有限公司；D101大孔吸附树脂，安徽省蚌埠市辽源新材料有限公司；甲醇(色谱纯)，天津市致远化学试剂有限公司；甲酸(色谱纯)，天津市致远化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯；氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCL)，四川西陇化工有限公司。

Anglient HPLC 1260高效液相色谱仪，配有可变波长紫外检测器、示差折光检测器和EZChrom Elite工作站美国安捷伦公司；RE100-Pro旋转蒸发仪 美国Scilogex公司；DZG-303A“艾柯”实验室专用超纯水仪 成都唐氏康宁科技发展有限公司；eppendorf 5810R冷冻型台式大容量高速离心机 德国eppendorf；pHS-3C型酸度计 上海雷磁仪器厂；SK7200H型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

(1)标准溶液配置

准确秤取芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素各5 mg；分别加入甲醇溶液溶解后定容到10 mL容量瓶，得到浓度分别为0.5 mg/mL的标准溶液。检测限与定量限按照《中华人民共和国药典》确定5种对照品的检测限与定量限[22]。

(2)标准曲线绘制

准确吸取标准溶液，配制成不同质量浓度的溶液，其中芦丁标准溶液的浓度梯度为0.001、0.002、0.002 5、0.006、0.015 和0.02 mg/mL，槲皮苷标准溶液的浓度梯度为0.001、0.002、0.003、0.004、0.008、0.012和0.016 mg/mL，槲皮素标准溶液的浓度梯度为0.001 、0.005、0.01、0.015、0.02和0.025 mg/mL，山奈酚标准溶液的浓度梯度为0.001、0.002、0.003 、0.004、0.008、0.012和0.016 mg/mL，异鼠李素标准溶液的浓度梯度为0.001、0.002、0.003 、0.004 、0.008、0.012和0.016 mg/mL，每次吸样量为20 μL，经过高效液相色谱检测。以峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 样品前处理

石榴皮粉末的制备[3]：将石榴样品洗净后取皮，剔除褐变及腐烂部分果皮，置于40 ℃恒温干燥箱内烘干，用研磨机粉碎，过100目筛，置于干燥器中避光保存备用。

黄酮类化合物的提取[3]：称取石榴皮粉末1.00 g，置于250 mL锥形瓶中，加入24 mL87%乙醇，59 ℃超声26 min，抽滤，再用24 mL95%乙醇溶解滤渣，超声26 min，合并滤液。30 ℃减压回收溶剂至近干，加10 mL 30%乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，收集样品用30%乙醇定容至50 mL容量瓶中。吸取1 mL于25 mL容量瓶中，30%乙醇定容至刻度，摇匀备用。

树脂的预处理[1]：将D101大孔树脂中的破碎树脂剔除，用蒸馏水浸泡洗去杂物，乙醇浸泡48 h使其溶胀，再用蒸馏水洗至无醇味。在内径10 mm，高300 mm的玻璃层析柱中湿法装柱后，用4% HCl溶液以3～5 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2 h，而后用去离子水以同样流速洗至出水pH为中性；再用4% NaOH溶液，以3～5 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2 h，而后用去离子水以同样流速洗至出水pH中性。备用。

1.2.3 样品溶液纯化

利用D101大孔吸附树脂，在温度30 ℃、吸附料液比1:4(g/mL)、pH为4、洗脱液体积为90%的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用30 mL乙醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液定容至50 mL，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 HPLC色谱条件

色谱柱：C18柱(Agilent Poroshell 120 EC-C18柱，250 mm× 4.6 mm，孔径4 μm；)；流动相：100%甲醇: 0.2%甲酸=55: 45，流动相经0.45 μm滤膜过滤，并经超声波脱气；流速：0.5 mL/min，进样量20 μL，柱温40 ℃，；检测波长：360 nm。

2 结果与分析

2.1 5种类黄酮标准品色谱图

研究表明,5种类黄酮标准品流出顺序分别为芦丁(保留时间为6.95 min)，槲皮苷(保留时间为8.25 min)，槲皮素(保留时间为12.12 min)，山奈酚(保留时间为18.20 min)，异鼠李素(保留时间为21.1 min)。图1

图1 对照品中5种类黄酮色谱图

Fig.1 HPLC chromatograms of 5flavonoids in standard products

2.2 线性范围、检出限、定量限

研究表明,芦丁、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品的检测浓度在对应的线性范围内与峰面积积峰值成良好的线性关系。

芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素定量限(信噪比10∶1)分别为 0.325、0.504、0.364、0.552及 0.447 μg/mL，检测限(信噪比 3∶1)分别为0.134、0.152、0.165、0.226及0.207 μg/mL。表1

表1 5种类黄酮的线性关系Table.1 Linearity determination of the flavonoids

组分Component回归方程RegressionequationR2线性范围(μg/mL)芦丁RutinY=2.83870×10-9X-0.0001516430.99191^20槲皮苷QuercitrinY=3.313960×10-9X-0.0001416780.99911^16槲皮素QuercetinY=2.127470×10-9X+0.0003521180.99911^30山奈酚ShanafelY=1.310520×10-9X+0.0002207290.99941^16异鼠李素HeterodermLisuY=2.404460×10-9X+0.0001217310.99971^16

注:回归方程中X代表峰面积,Y代表质量浓度。

2.3 回收率

准确称取5种类黄酮含量已知的皮亚曼石榴皮粉末、赛柠檬石榴皮粉末、千籽红石榴皮粉末和叶城石榴皮粉末各6份，分别向其中定量添加混合标准溶液，并按照1.2.2的方法制备供试品溶液，按1.2.4的色谱条件进样20 μL，根据测定结果中5种单体黄酮的含量计算相应的回收率。表2

表 2 加标回收率测定结果(n = 6)

Table 2 experiment results of recovery (n = 6)

化合物Compound样品量SampleQuantity(mg/100g)添加量Addition(mg/100g)测得量Measuredamount(mg/100g)平均回收率Averagerecoveryrate(%)皮亚曼石榴皮PiyamanPomegranateskin芦丁14.737.54888.8槲皮苷160.2294532.5126.6槲皮素2.32023103.5山奈酚1.3201778.5异鼠李素0.52018.591.13赛柠檬石榴皮SainingmengPomegranateskin芦丁13.237.547.591.4槲皮苷129.5294439105.2槲皮素1.92023.5108山奈酚12026124.47异鼠李素02022108.27千籽红石榴皮QianzihongPomegranateskin芦丁7.537.541.590.6槲皮苷127.7294468115.7槲皮素1.52022.5105.98山奈酚1201884.41异鼠李素02021.5105.87叶城石榴皮YechenPomegranateskin芦丁14.837.54888.5槲皮苷79.5294408111.7槲皮素3.52024.5103.60山奈酚2.5201982.80异鼠李素22021.597.40

2.4 精密度

在对方法进行验证的过程中，分别对皮亚曼、千籽红、赛柠檬和叶城石榴4个石榴品种类黄酮提取物进行了测试，按照1.4.1色谱条件进样20 μL，重复进样6次，计算不同进样次数对应的峰面积，得不同品种石榴皮类黄酮提取物对应的RSD平均值。芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素分别对应的RSD为1.25%，1.19%，1.80%，0.82%，0.19%。该方法精密度良好，可以满足石榴皮类黄酮检测要求。

2.5 重复性实验

准确称取皮亚曼、千籽红、赛柠檬和叶城石榴石榴皮各1.000 g，平行制备6份样品溶液，按照HPLC色谱条件，进样20 μL，按照HPLC色谱条件，进样20 μL，计算每一份芦丁对应的峰面积，得平均RSD均小于2%，该方法重复性良好。表3

表3 重复性(n=6)

Table 3 Reproducibility test (n=6)

实验号Nomber叶城酸石榴芦丁含量RutincontentofYechen(mg/100g)皮亚曼石榴芦丁含量RutincontentofPiyaman(mg/100g)赛柠檬石榴芦丁含量RutincontentofSainingmeng(mg/100g)千籽红石榴芦丁含量RutincontentofQianzihong(mg/100g)10.226670.32196440.27109580.19166320.22674980.32740670.26348150.194831330.22245350.32757350.2679950.192947340.23070050.33263540.27653630.191272750.22550120.32429540.27373130.190705460.22587020.32567630.27461720.1927679平均值0.22632420.3265920.27124290.1923646SD2.42619E-053.30851E-054.40469E-051.3555E-05RSD0.010719990.0101304010.0162389290.007046499

2.6 稳定性实验

准确称取皮亚曼石榴皮样品，按照样品溶液制备方法制备进样溶液，在2.1.5色谱条件下，分别于1、3、5、7、9、11h进样，测定样品溶液中的5种类黄酮物质中槲皮苷的含量，计算RSD值均小于2%。表明供试品溶液在11 h内稳定，该方法稳定性良好。

2.7 不同品种石榴皮中5种类黄酮物质测

研究表明,4个石榴品种果皮中均检测到芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素这5种类黄酮组分，且槲皮苷和芦丁是石榴皮5种类黄酮中的主体成分：叶城石榴皮中芦丁、槲皮苷分别占13.8%和76.7%，合计90.5%。皮亚曼石榴皮中芦丁、槲皮苷分别占8.1%和89.2%，合计97.3%。赛柠檬石榴皮中芦丁、槲皮苷分别占9.08%和88%，合计97.08%。千籽红石榴皮中芦丁、槲皮苷分别占5.5%和91.6%，合计97.1%。槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量较低。图2

图2 石榴皮提取物中5种类黄酮色谱图

Fig.2 HPLC chromatograms of 5flavonoids in pomegranate leather extracts

皮亚曼石榴皮中槲皮苷含量是叶城石榴皮的1.84倍，赛柠檬和千籽红石榴皮中槲皮苷含量低于皮亚曼，且高于叶城石榴皮1.5倍，4个品种中千籽红石榴皮芦丁含量低于其他品种。不同品种石榴皮提取物中芦丁、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚总含量由高到低为：皮亚曼石榴皮>赛柠檬石榴皮>千籽红石榴皮>叶城石榴皮。表4

表4 不同品种石榴果皮中5种类黄酮物质含量(n=3)

Table 4 Contents of five flavonoids in peels of pomegranate (n=3) (mg/100 g)

类黄酮物质Flavonoids芦丁Rutin槲皮苷Quercitrin槲皮素Quercetin山奈酚Shanafel异鼠李素HeterodermLisu总和Sum叶城Yecheng15.8±0.587.8±0.84.6±0.43.3±0.12.9±0.6114.5±0.6皮亚曼Piyaman14.7±0.7162.2±0.32.6±0.21.3±0.20.7±0.4181.7±0.3赛柠檬Sainingmeng13.6±0.2131.7±0.82.4±0.51.2±0.60.6±0.8149.7±0.2千籽红Qianzihong7.9±0.6131.7±0.82.2±0.11.1±0.70.6±0.5143.8±0.4

3 讨 论

类黄酮物质是石榴中重要功能性物质之一，是评价石榴果实品质的重要指标[23-24]。de Pascual-Teresa[10]等从石榴果皮中检测出4种黄烷醇。朱峰[8]等从泰山红、大青皮、墨石榴和三白4个石榴品种果皮中检测到杨梅酮、槲皮素、木犀草素、山奈素、芹菜素5种类黄酮物质。试验采用HPLC在4个石榴品种中检测到5种类黄酮组分物质，分别为芦丁、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚，5种类黄酮含量最高的品种为皮亚曼石榴，总含量为181.7 mg/100 g,其次为赛柠檬石榴，含量为149.7 mg/100 g，千籽红石榴类黄酮含量为143.8 mg/100 g，叶城石榴类黄酮含量较低，为114.5 mg/100 g。研究与上述报道有差别，原因可能与不同品种有关，此外可能还与生长环境、贮存条件、成熟程度等多种因素有关。

研究显示不同石榴品种类黄酮组分和含量有一定差异性，在皮亚曼石榴果皮中，其类黄酮含量整体较高，是石榴功能食品育种的优异资源。另外，在目前的石榴加工产业中，石榴皮大多数都被废弃扔掉，研究显示石榴皮具有较高的开发利用价值。

4 结 论

建立的高效液相色谱分析方法在21 min内完成芦丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素5种类黄酮的分离，分离度较好。5种类黄酮化合物的标准曲线线性线性关系良好，其精密度实验结果相对标准偏差均<2%，回收率在76.68%～124.50%范围类，检出限为0.2 mg/kg，定量限为5 mg/kg，是一种检测分析石榴类黄酮组成和含量的简便、快速和准确的方法。