黄芪多糖提取、纯化及其应用研究进展

臧凯，张萍，袁彩彩，石贤才，章亚东

(郑州大学 化工与能源学院 郑州大学济源研究院，河南 郑州 450001)

黄芪主要分为荚膜黄芪和内蒙古黄芪两种，在黑龙江、内蒙古、江西等地均有分布。黄芪性甘，微温，在我国有2 000多年的药用历史，对黄芪的记载始见于《马王堆帛书五十二病方》，黄芪与芍药、甘草等复配使用可以治疗疽病。

黄芪含有黄芪皂苷、多糖、蛋白质、黄酮等有效成分，多糖是黄芪的水溶性主要成分之一[1]。黄芪多糖具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等生理功能。黄芪多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成。由于其具有突出的生理功能，黄芪多糖已经成为医疗、食品、养殖等方面的研究热点。本文就黄芪多糖提取、纯化及其应用进行综述，以期为黄芪多糖的进一步开发利用提供参考。

1 黄芪多糖的提取

在黄芪多糖的提取过程中可以先用石油醚、乙醇脱脂处理，这样可以使多糖更易溶出。黄芪多糖的提取方法有溶剂法、酶辅助法、微生物发酵法、物理强化法等。

1.1 溶剂法

溶剂法是工业上较常用的提取方法，操作方便、成本低但其提取时间长、温度高、会导致活性组分失活。表1中列举了3种溶剂法提取黄芪多糖的提取率。

表1 溶剂法提取黄芪多糖提取率Table 1 Solvent method Astragalus polysaccharide extraction rate

1.2 酶辅助提取

酶能破坏细胞壁结构，减少细胞壁和细胞间质的阻力，提高提取率。Chen等[4]比较了纤维素酶、果胶酶等8种酶对黄芪多糖的提取率，发现葡萄糖氧化酶的效果最好，并用响应面法优化提取工艺：酶量3.0%，处理时间3.44 d，处理温度56.9 ℃，提取溶剂pH 7.8，在此条件下，黄芪多糖的提取率达到(29.96±0.14)%，与没有酶辅助相比提高了250%。董玲玲[5]将微波和纤维素酶提取联合使用，多糖的提取率达到16.07%。除此之外，在植物提取的过程中也常将多种酶共同使用[6]。使用酶进行辅助提取污染小，方法简单，成本较低，但酶对环境条件的要求较高，需要严格控制环境条件。

1.3 微生物发酵提取

微生物发酵提取是利用细菌或真菌等微生物在代谢过程产生的多种酶对提取底物进行作用。这些酶能破坏或修饰细胞壁的结构，使中药中的活性成分更容易释放出来，还能将多糖降解为小分子多糖并转化为其他类型的多糖。边亚彬[7]优化了非解乳链球菌(FGM)发酵黄芪多糖的工艺，在提取时间65 min，提取温度80 ℃，料液比为1∶9的条件下，发酵黄芪多糖的含量为6.72 mg/mL，并证实发酵黄芪多糖能促进小鼠骨髓原DC的成熟。苏贵龙[8]发现FGM和枯草芽孢杆菌，FGM 固、液两步法两种方法均能提高发酵黄芪根、茎、叶多糖的得率。发酵提取中药有效成分，不仅能提高提取效率，同时还能降低中药的毒副作用。

1.4 物理强化法

近年来常用的物理强化法有超声辅助提取、微波辅助提取、负压空化提取等。物理强化法是用物理方法破坏细胞结构，使多糖从细胞内流出，从而达到提高提取率的目的，也是近年来植物提取中常用的方法。超声、微波辅助提取与负压空化提取相比，提取率较低且前人已对其进行了详细的综述，本文就不再对其进行展开说明。表2列举了物理强化法提取黄芪多糖的提取率。

表2 物理强化法提取黄芪多糖提取率Table 2 Physical enhancement method Astragalus polysaccharide extraction rate

负压空化运用强烈的空化作用和机械振动加快植物组织中有效成分进入溶剂，实现短时间和低温提取[12]。既可以保护植物中的热敏性物质不被破坏，同时又可以减少因高温分解而产生的蛋白质、淀粉等大分子杂质。Jiao等[13]对均质辅助负压空化提取黄芪多糖的工艺进行了优化，在均质时间70 s，负压-0.068 MPa，提取温度64.8 ℃，水料比1∶13.4，提取时间53 min的条件下提取率为16.74%。同时FTIR结果表明，此法不改变黄芪多糖的一级结构。与传统的热水提取方法相比，负压空化提取具有提取率高、条件温和等优点。在其他植物的提取中有将负压空化和其他提取方法进行连用，田莉等[14]优化了减压耦合超声提取苹果渣多酚的工艺，得到的多酚提取液的还原能力要大于超声提取所得到的。

热水浸提法虽然提取率低，但适用于工业化大规模提取。超声、微波辅助提取对工艺设备要求高，不适合大规模生产应用。酶辅助提取高效，但对环境要求高。微生物发酵中，需要解决如何选育优良的菌种的问题[15]。研究表明提取温度能通过影响黄芪多糖的结构影响其生理活性[16]，每一种方法都有优缺点，如何扬长避短，实现低温、高效提取应是以后黄芪多糖提取研究重点。

2 黄芪多糖的纯化

2.1 脱蛋白

有报道表明黄芪粗多糖中蛋白质的含量大于15%。除去蛋白质是获得高活性、高价值黄芪多糖产品的重要步骤。黄芪多糖常用的脱蛋白方法见表3。

表3 黄芪多糖除蛋白的主要方法及其优缺点Table 3 The main methods of removing protein from Astragalus membranaceus polysaccharides and their advantagesand disadvantages

为了便于操作，提高多糖的得率，近年来通常将酶法和Sevage法联用。胡媛媛[20]对蛋白酶和Sevayge法联用脱蛋白工艺进行优化，在酶底比2.0%，pH 5.0，50 ℃水浴酶解24 h时效果最好，蛋白脱除率89.82%，黄芪多糖质量分数83.47%。酶法和Sevage法连用，去除蛋白质效果好且多糖的损失率较低，同时又简化了操作。

2.2 黄芪多糖纯化

2.2.1 分级沉淀法 多糖的结构和分子量不同会导致其极性不同，从而导致它们在有机溶剂中的溶解度不同，根据这一原理，可以依次增加有机溶剂的浓度，将不同分子量的多糖沉淀出来。在多糖的分级沉淀中乙醇是常用的一种沉淀剂。李红发等[21]采用30%，50%，70%，75%，80%，90%的乙醇溶液对黄芪多糖进行分级沉淀，得到6个不同组分。分别对各个组分结构、组成及其抗氧化性进行分析，结果表明随着乙醇浓度的增加，得到的多糖的分子量逐渐降低，多糖中半乳糖、甘露糖和鼠李糖的含量依次升高，葡萄糖的含量依次降低，但抗氧化活性增强，且抗氧化活性与多糖的结构有关。

2.2.2 柱层析法 在黄芪多糖的分离纯化中用的最广泛的是离子交换柱层析和凝胶柱层析。离子交换柱层析主要用于多糖粗提液中单组分多糖的粗分离。依据被分离多糖的结构、分子量的大小使用不同规格的凝胶柱层析能实现多糖的分离或进一步纯化。屈静等[22]使用SephadexCL-6B凝胶柱，0.9%NaCl作为洗脱剂，对脱蛋白的黄芪多糖进行柱层析，得到分子量为5 600 Da，含量为96.3%的均一多糖。王瑞遵[23]先用DEA-Cellulose离子交换柱层析，以0.5 mol/L NaCl为洗脱剂，将黄芪多糖进行粗分离，得到两个组分，之后用SephadexCL-6B凝胶柱，以0.15 mol/L NaCl为洗脱剂，对多糖进一步纯化，得到AMPSA-a、AMPSA-b、AMPSA-c、AMPSB-d 4种四个分子量且各个组分多糖均具有显著的抗氧化作用。

2.2.3 膜分离 在常温下进行的膜分离过程，具有不使用有机溶剂、分离选择性高、易于与其他方法连用等优点。超滤法是20世纪60年代兴起的膜分离技术，因其产率高且对产物的破坏极小，广范地用于植物的分离提纯。张庆雷[24]将超频震动膜过滤技术与乙醇分级沉淀法用于黄芪多糖纯化，发现前者易得到分子量比较均一的多糖。唐雨微[25]利用不同截留量(150，100，50，20，10，6 kDa)的中空纤维膜，在0.1 MPa压力下，将脱蛋白的黄芪多糖分成7组，经DEAE-Cellulose和Sephadex G-100柱层析进行分离，得到6个多糖，研究表明得到的多糖具有微生态调节功能。

目前对黄芪多糖的分离纯化方法比较固定，可以参照其他多糖的分离纯化工艺，以便更好的对黄芪多糖进行纯化，例如应用膜集成技术对多糖进行分离纯化：微滤和超滤分离纯化茶多糖，可以得到两个组分。除此之外常用的膜分离法还有微滤、纳滤等，在黄芪多糖的纯化中应用的较少，但已用于其他植物多糖的纯化，在黄芪多糖的分离纯化中可以借鉴。

3 应用

3.1 医疗

由于黄芪多糖具有良好的免疫调节、抗肿瘤、抗炎等药理作用。目前黄芪多糖在疾病的治疗中取得了较大的进展。在临床上已经用于治疗肿瘤、哮喘、糖尿病方面的疾病。对其他一些疾病的治疗还停留动物试验阶段。

3.1.1 肿瘤 高死亡率使癌症成为全球人类健康的主要威胁。目前治疗癌症的主要方法是化疗，但化疗往往伴随着一些毒副反应，还可能产生耐药性。黄芪多糖在增强机体免疫、抑制肿瘤生长和促进细胞凋亡的同时还能降低药物的毒副作用。近年来黄芪多糖在治疗癌症方面发展迅猛。有研究表明黄芪多糖对胃癌MGC-803细胞，人非小细胞肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞具有抑制作用，可诱导胃癌MGC-803细胞凋亡[26]。杨晓岚[27]将注射性黄芪多糖和放疗结合用于胃癌的治疗，联合治疗组癌症治疗率、肿瘤体积变小率分别为63.9%，59%，而对照组分别为53%，51.8%，同时联合治疗组患者的免疫、造血和肝肾的功能水平与对照组相比明显提高。张莹等[28]将黄芪多糖和细胞因子诱导的杀伤细胞联合治疗中晚期气虚型非小细胞肺癌。疾病控制率和卡氏评分分别为联合治疗组69.4%，77.8%，对照组为36.1%，55.6%。此外黄芪多糖还可以和吉西他滨联用，治疗胰腺癌，和阿霉素脂质体连用治疗肝癌等。

3.1.2 哮喘 黄芪多糖可能通过调节免疫细胞功能和细胞因子表达，增强抗炎活性，从而对呼吸系统疾病起到较好的作用。在常规治疗的基础上给哮喘患者注射黄芪多糖注射液能显著降低患者BALF或痰液所含炎症细胞水平[29]，维持免疫平衡，提高机体免疫能力，同时恢复肺功能，降低不良反应风险。另有研究表明黄芪多糖能通过对T淋巴细胞发挥免疫调控作用，改善患者免疫应激状况，提高患者免疫力，从而提高支气管哮喘患者治愈率[30]。

3.1.3 糖尿病 黄芪多糖能够通过调节患者的免疫功能、减少炎症反应，改善患者的肾功能。邓海鸥等[31]用黄芪多糖注射液治疗老年早期糖尿病肾。赖瑜[32]研究表明，黄芪多糖和三黄化瘀汤联合使用能降低糖尿病肾病早期患者中血清中炎症因子血浆纤溶酶原激活物抑制因子-1的含量。

3.1.4 其他 此外黄芪多糖也可用于治疗心血管、神经系统方面的疾病。 陈添华[33]的研究表明，黄芪多糖对AngⅡ刺激引起的心肌细胞肥大及炎症反应有良好的保护作用。王爱青[34]证实黄芪多糖对急性高眼压大鼠视网膜损伤具有保护作用，与用药剂量相关。

3.2 食品 《保健食品原料手册》一书指出黄芪多糖可作为保健食品原料使用。周关键等人以黄芪多糖、银杏叶提取物和富硒黑番茄为主要的功能成分，研发出一种对糖尿病并发症具有防治作用的面条。邵宝平等[35]以黄芪多糖为原料研制出一种口感舒适、色泽良好具有增强免疫抗疲劳的功能饮料。

3.3 养殖

3.3.1 免疫增强剂 黄芪多糖能改善血清环境，激发机体免疫应答反应，促进细胞因子分泌，增强体内抗体水平来增强疫苗的效果。Zhu等[36]通过实时定量RT-PCR检测表明，在脾脏和头肾组织中，炎症细胞因子IL-1β的mRNA表达在免疫早期增加，激发Th1免疫应答反应，整个免疫期细胞因子IL-2、IFN-γ2升高，血清中IgM明显增强，黄芪多糖可增强黄鲶爱德华氏菌疫苗效力。

黄芪多糖作为天然的饲料添加剂不仅能提高机体的免疫力同时还能提高机体的生产性能。陈亚军[37]发现当黄芪多糖在饲料中的添加量为50～400 mg/kg 时，能显著的增强泥鳅的非特异性免疫和抗氧化能力。这可能是由于黄芪多糖能提高白细胞、红细胞和血清中NO的含量造成的。Wu等[38]的研究证实1 g/kg黄芪多糖喂食肉鸡能促进幼年肉鸡的生长。与对照组相比，肉鸡体内淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性更高，但黄芪多糖含量过高时，则会降低消化酶的活性。

3.3.2 生殖 人工授精广泛的应用于现代猪场中，液氮保存精液寿命短，冷冻保存可延长精液的寿命。在精液的冷冻解冻过程中，怎样为精子建立一个强大的抗氧化体系已成为人们急需解决的问题。黄芪多糖具有良好的抗氧化功能，因此黄芪多糖有可能会成为解决这一问题的不错选择。Fu等[39]研究证实黄芪多糖可以通过影响活性氧进入环腺苷磷酸的途径，从而对精子蛋白的去磷脂化进行抑制。宋健[40]研究证明黄芪多糖能够通过降低猪解冻精液活性氧的含量，提高精子的抗氧化能力，从而提高体外受精效率及胚胎发育能力。

4 讨论与展望

黄芪多糖具有极高的应用价值，目前关于黄芪多糖的研究虽然取得了很大的进展，但还存在一些问题如：(1)目前的很多研究并未对其构效关系进行说明，这就需要完善黄芪多糖的制备方法，借助指纹谱图技术、相似度分析和聚类分析等技术[41]来研究黄芪多糖的结构，制定质量控制方案如确定其有效片段的分子量范围；(2)黄芪多糖是保健食品原料，但目前市场上与黄芪多糖相关的保健品并不多见，可以进一步完善黄芪多糖的作用机制，加强食品方面的研究力度；(3)在医疗(如神经系统、心血管疾病等)方面，还只停留在动物实验上，可加强这方面的深入研究，进一步推动临床开发和应用；(4)黄芪多糖具有清除自由基[42]的功能，有望成为抗衰老、抗氧化化妆品的活性成分。