氯化钠滴眼液中防腐剂苯扎氯铵的含量测定

谷成燕，贺艳丽，白若琬，韩保萍

（山东博士伦福瑞达制药有限公司，山东 济南 250101）

氯化钠滴眼液的主要成分为氯化钠，其次还含有玻璃酸钠等成分，主要用于缓解眼睛疲劳引起的局部干涩。该滴眼剂为多剂量剂型，制剂中加入了抑菌剂苯扎氯铵。为控制产品质量，保证滴眼液的用药安全，需要对苯扎氯铵的含量进行控制。本文依据美国药典苯扎氯铵[1]含量测定的色谱条件，对进样体积及流速进行了优化，根据药品质量标准分析方法验证指导原则[2]及美国药典34＜621＞[1]的要求，对该方法进行了系统适用性、专属性、准确度、精密度、线性和范围及耐用性的验证，结果表明，该法能有效测定本品苯扎氯铵含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型液相色谱仪，Waters 2998 PDA检测器（美国沃特世公司）；Agilent Technologies 1260 infinity液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BP211D电子天平（赛多利斯）；XP205电子分析天平（梅特勒-托利多）；FE-20 S20K型酸度计（梅特勒-托利多）；DHG-9030A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器）；YB-3型澄明度检测仪（天津大学精密仪器厂）。

1.2 试药

氯化钠滴眼液（山东博士伦福瑞达）；苯扎氯铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号201102，按C22H40ClN计，每1 ml中含苯扎氯铵为11.10 mg）；注射用玻璃酸酶（1500单位/瓶，上海上药第一生化药业）；无水醋酸钠，冰醋酸（分析纯，天津科密欧）；乙腈（色谱纯，Dikma Tech）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 空白溶液 按处方组份及比例（除氯化钠外）配制。

2.1.2 对照品溶液 精密量取苯扎氯铵对照品适量，用水定量稀释制成每1 ml中含30 μg溶液。

2.1.3 供试品溶液 供试品用注射用玻璃酸酶酶解[3-4]（酶解温度为37±0.5 ℃，酶浓度为60单位/ml，酶解时间为20 min）后直接进样。

2.2 色谱条件及优化

2.2.1 美国药典苯扎氯铵测定色谱条件 用氰基硅烷键合硅胶为填充剂；以醋酸钠溶液（无水醋酸钠8.2 g，加水1000 ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至5.0）-乙腈（55：45）为流动相；流速为2 ml/min；检测波长为262 nm。

该色谱条件下苯扎氯铵的测定浓度为4 mg/ml，进样体积为20 μl，则进样量为80 μg，本品中苯扎氯铵浓度为30 μg/ml，选用最大进样体积100 μl，则进样量为3 μg。试验结果表明，该色谱条件下，苯扎氯铵拖尾因子为1.0～1.3，相邻峰之间分离度为2.0～2.1，系统适用性符合要求。

2.2.2 参数选择及优化

2.2.2.1 检测波长的选择 从供试品全波长扫描光谱图可知，苯扎氯铵在209 nm与262 nm的波长处有最大吸收。因流动相中含有的醋酸盐在酸性条件下形成醋酸（吸收波长为210 nm），其浓度远高于分析物，导致其210 nm处强烈的底吸收完全掩盖了苯扎氯铵的紫外吸收，为避免209 nm处流动相的干扰，选择262 nm作为苯扎氯铵含量测定的检测波长，与中国药典妥布霉素滴眼液等[5]品种下苯扎氯铵含量测定的检测波长一致。

2.2.2.2 流速的选择 由于本品中苯扎氯铵含量较低，为提高测定的准确度，需选择较高的灵敏度，提高峰面积的响应因子，而当进样量一定时，PDA检测器的积分响应值（峰面积）与流动相流速成反比[6]，因此需选择较低的柱流速进行含量测定。依据中国药典常见流速，设定流速为1 ml/min，并将测定结果与流速为2 ml/min进行比较。在不同的流速下测定同一供试品中苯扎氯铵的含量，其一致性为99.6 %。苯扎氯铵峰的响应因子随着流速的增大而减小，流速为1 ml/min的响应因子约为2 ml/min的2倍。为增大其响应因子，提高测定的灵敏度与准确度，选择流速为1 ml/min。

2.2.2.3 进样体积的选择 为使方法具有良好的分离度与检测灵敏度，需选择合适的进样量。进样量过大，可能导致色谱柱超载，致使样品峰展宽，峰形改变；进样量过小，又可能导致方法灵敏度过低。本品中含苯扎氯铵浓度仅为0.003 %，因此采用直接进样对其进行测定，为避免进样量对分离及测定结果的影响，需选择合适的进样体积。通过不同进样体积的供试品溶液的重复性结果与苯扎氯铵拖尾因子大小，为保证良好的重复性，同时减小柱负载，选择进样体积为80 μl。

2.3 专属性试验

2.3.1 酸（碱、氧化）破坏 取本品及苯扎氯铵空白各8 ml，分别置入安瓿，加1 mol/L盐酸溶液（1mol/L氢氧化钠溶液、3 %过氧化氢溶液）各1 ml，摇匀，密封，室温放置48 h，取出，加入1 mol/L氢氧化钠溶液（1 mol/L盐酸溶液、水）1 ml，得约80 %浓度供试品溶液。

2.3.2 高温（光照）破坏 取本品及苯扎氯铵空白各适量，分别置安瓿（石英器皿）中，密封，于60 ℃烘箱（照度为3500 lx日光灯）中放置48 h，取出，放冷。

2.3.3 试验结果 溶剂及空白溶液对本品中苯扎氯铵测定无干扰，破坏试验后空白溶液在苯扎氯铵峰处无新的色谱峰。由表1可见，破坏后供试品中苯扎氯铵色谱峰纯度角均小于纯度阈值。

表1 专属性试验结果

2.4 耐用性试验

根据美国药典色谱条件系统适用性要求，对流动相pH值、缓冲盐浓度及比例、检测波长、进样体积、柱温、色谱柱及流速进行考察。结果见表2。

表2 耐用性试验结果

由表2可见，变化前后，各色谱条件下供试品中苯扎氯铵含量测定结果的RSD为0.3 %～1.6 %（n=6），对照品溶液分离度及拖尾因子均符合要求。

2.5 线性

精密量取苯扎氯铵适量，置入100 ml量瓶，加水定量稀释制成每1 ml中含0.6 mg溶液，作为储备液。精密量取储备液适量，分别加水定量稀释制成每1 ml含15，22.5，30，36，45 μg溶液，作为线性溶液。精密量取各线性溶液80 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。用峰面积（Y）对线性溶液浓度（X）进行线性回归，线性方程为Y= 4994.9X-2248.1，相关系数r=0.9999。

2.6 准确度试验

取苯扎氯铵对照品适量，用空白溶液制成50 %，100 %和150 %苯扎氯铵浓度水平的溶液，作为供试品溶液。另精密量取苯扎氯铵对照品适量，加水定量稀释制成每1 ml中含30 µg溶液，作为对照品溶液。每种浓度水平的溶液分别制备3份。各浓度水平的回收率见表3。结果显示回收率良好。

表3 准确度试验结果

2.7 精密度试验

2.7.1 进样精密度 取对照品溶液，连续进样6次，计算峰面积及保留时间的RSD。苯扎氯铵峰面积的RSD为0.4 %，峰1保留时间的RSD为0.2 %，峰2保留时间的RSD为0.2 %。

2.7.2 重复性 取本品适量，作为供试品溶液，平行制备6份；另精密量取苯扎氯铵对照品适量，加水定量稀释制成每1 ml中含30 µg溶液，作为对照品溶液。6份供试品中苯扎氯铵含量测定结果的RSD为0.4 %。

2.7.3 中间精密度 由不同分析人员在不同的日期使用不同的仪器进行重复性试验。试验者I和试验者II的共12份供试品溶液中苯扎氯铵含量测定结果的RSD为0.8 %，二者的平均一致性为99.6 %。

2.8 范围

根据线性、准确度、精密度等试验结果，确定本法的适用范围为50 %～150 %（以相当于供试品溶液浓度百分比计）。

3 讨论

（1）苯扎氯铵系广谱杀菌剂，是滴眼液中比较常见的防腐剂，化学名称为氯化二甲基苄基烃铵，属季铵基类化合物。中国药典收载的妥布霉素滴眼液与硫酸新霉素滴眼液质量标准中均有苯扎氯铵含量测定方法，二者色谱条件完全一致，但是色谱条件中添加了扫尾剂三乙胺以减小峰拖尾，由于三乙胺会对色谱柱的性质造成一种不可逆转的改变[7]，因此使其不再适合应用于流动相中不含三乙胺成分的检测，所以本品参照《美国药典》中苯扎氯铵的测定方法，优化后确定了本品中苯扎氯铵的测定方法，经方法学验证，该方法可行。

（2）苯扎氯铵为氯化烷基二甲基苄铵的混合物，主要由3种正烷烃基（n-C12H25、n-C14H29、n-C16H33）取代的二甲基苄基氯化铵的同系物组成[8]，采用中检院对照品在我们的色谱条件下有3个色谱峰，而样品只有一个色谱峰，可能与国产原料有关。实际测定时，保留时间为为3.8 min的色谱峰信噪比S/N约为6.7，低于定量限，为准确定量，在计算本品中苯扎氯铵含量时，不将此峰计算在内。按同系物峰面积的和值计算含量。典型图谱见图1～2 。

图1 苯扎氯铵中检院对照品

图2 苯扎氯铵国产原料