自制与市售豆瓣中的酵母菌分离与分析

2019-11-04罗睿星谢义鹏

科技资讯 2019年20期

罗睿星　谢义鹏

摘要：酵母菌是食品酿造过程中的重要微生物，能代谢产生多种有利于食品安全或风味的化合物。豆瓣是四川地区重要的酿造食品，但关于酵母菌在其中的作用研究较少，该研究对自制和市售的样品使用平皿划线法进行菌种分离纯化，分离获得了两株形态不同的酵母菌，利用平皿菌落计数法对获得的酵母菌计数，通过显微镜对菌落形态进行观察。结果表明：豆瓣中存在数量较多的酵母菌，无论是自制还是市售的豆瓣，其含有的大量酵母菌是其具有独特酯香、醇香的物质基础来源，也证明了在传统的风味食品中酵母菌起着至关重要的作用。

关键词：豆瓣酵母菌纯化菌落

中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）07（b）-0195-03

Abstract： Yeast is an important microorganism in the food brewing process and can be metabolized to produce a variety of compounds which are beneficial to food safety or flavor. Watercress is an important brewing food in Sichuan area. However， there are few studies on the role of yeast in this field. In this study， the self-made and commercially available samples were isolated and purified by using the plate scribing method and two strains of different yeasts were isolated. For the bacteria， the obtained yeasts were counted by a plate colony counting method and the colony morphology was observed by a microscope. The results showed that there were a large number of yeasts in the watercress. Whether it was homemade or commercially available watercress， the large amount of yeast contained in it was the basis of its unique ester and mellow substance which also proved to be in traditional flavor foods.

Key Words： Watercress; Yeast; Purification; Colony

酵母菌是釀造食品中的重要微生物，葡萄酒、果酒、啤酒、白酒等酒类饮品中的醇香、酯香主要来源于酵母菌的发酵，面包、馒头等食品制作中的发泡来源于酵母菌生长产生的二氧化碳，其他的食品如酵素、泡菜等，酵母菌也起着重要的作用[1]。

豆瓣是四川地区传统酿造食品，是川菜中不可缺少的调味品，具有“红褐油润、酱酯香浓郁、味甜醇厚”等特点。豆瓣中的酯香、醇香是否与酵母菌有关呢？为了解此问题，该实验选择了四川地区常用的两类豆瓣：家庭自制和企业生产，计数其中酵母菌的数量并分离纯化主要的酵母菌。

1 材料与方法

1.1 材料

家里自制豆瓣（贮存1年）、市售豆瓣（淘宝购，品牌：绍丰和，贮存3年）。

1.2 培养基

麦芽汁琼脂培养基（青岛海博生物生产，成分包括麦芽浸粉130.0g/L，氯霉素0.1g/L，pH5.6）

1.3 实验方法

1.3.1 酵母菌计数

平皿菌落计数法。

（1）培养基制作。

称取65.05g培养基，加热溶解于500mL蒸馏水中，分装于两个500mL三角瓶，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌15min。

（2）其他用具准备。

无菌生理盐水：称取5.4gNaCl，溶解于600mL蒸馏水中，分别分装于两个250mL三角瓶和8支18×180mm的试管，三角瓶中分装225mL，加入小玻璃珠10个，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，试管中分装9mL，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌30min。

无菌移液管8支：将10mL的移液管口塞上棉花，用牛皮纸包裹，121℃高压灭菌30min。

无菌培养皿20个：取直径9cm的培养皿20套，用牛皮纸包裹（分成两包），121℃高压灭菌30min。

无菌药匙2个：取2个不锈钢药匙1个，用牛皮纸包裹，121℃高压灭菌30min。

（3）样品稀释液制备。

将无菌操作间及洁净工作台的紫外灯打开照射30min，关上紫外灯，10min后进去操作。准确称取豆瓣样品25g，放入装有225mL无菌生理盐水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置摇床上室温振荡20min，静置20～30s，制成10-1稀释液;再用无菌移液管吸取10-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌生理盐水的试管中，吹吸3次，制成10-2稀释液;按照此方法，连续稀释，制成10-3、10-4、10-5的稀释液。

（4）平板接种培养。

取10-3、10-4、10-5两种稀释度菌液1mL放入无菌培养皿内，培养基加热熔化后冷却至50℃，迅速倒入平皿，盖上皿盖，每皿20～25mL，混合均匀，凝固后放入恒温培养箱，温度为28℃，正放2h后倒置培养3d。每个稀释度做3个平行样。

（5）计数。

选取菌落数在10-150 CFU的平板，计数平板上的菌落数，3个平行样菌落数的平均值乘以稀释倍数即为样品中酵母菌的数量。

1.3.2 菌种分离纯化

平皿划线法。

（1）培养基制作。

平皿培养基制作：称取13.01g培养基，加热溶解于100mL蒸馏水中，盛于250mL三角瓶，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌15min，灭菌锅自然降温，降至100℃以下后取出培养基，待培养基冷却至50℃后在无菌室中以无菌操作趁热倒入无菌的培养皿中，盖上皿盖，每皿15mL，凝固后放入28℃恒温培养箱培养2d，除去培养皿表面的水分。

斜面培养基制作：称取13.01g培养基，加热溶解于100 mL蒸馏水中，趁热分装于15×150mm的试管，每管5mL左右，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌15min，灭菌锅自然降温，降至100℃以下后取出培养基，趁热放在有斜度的实验台上，使其凝固后的斜面长度在试管的1/2～2/3，凝固后放入28℃恒温培养箱空白培养5d，除去培养基表面的水分，并检查斜面上有无菌苔生成，如有则弃之不用。

（2）划线。

挑取1.3.1步骤长出的菌落，在平皿培养基上划线，反复3次，挑取单菌落于斜面培养基上保藏。

（3）形态观察。

①菌落形态观察[2]。

无菌室中，以无菌操作从菌株斜面上挑取少量菌体划线在平皿培养基，28℃倒置培养3d，观察菌落的颜色、形状等。

②显微形态观察。

无菌室中操作。取一洁净的载玻片，中央滴一滴无菌生理盐水，用接种针以无菌操作从培养皿的菌落上，挑取少量菌体，放在载玻片的液滴中，并将菌体挑开，勿使成团，加上盖玻片，放在显微镜下观察。物镜先用20倍，再用40倍，观察细胞的形状、出芽等情况。

2 实验结果

2.1 酵母菌计数

家里自制豆瓣样品和市售豆瓣样品中均存在酵母菌，每克样品的酵母菌数均在一百万以上（见表1），市售豆瓣样品中菌数稍低于家里自制样品，可能因为市售样品贮存期较长而导致一些菌死亡。

2.2 酵母菌分离纯化

在两个样品中均分离纯化到两株酵母菌，分别命名为DBY-1、DBY-2。