反复上呼吸道感染患儿补充维生素D后LL-37、IL-10含量变化

(河北大学附属医院，河北 保定 071000)

反复上呼吸道感染是小儿常见病及多发病，具有反复发作的特点，严重影响儿童健康，并给家庭带来不小的经济负担。以往研究[1]显示，维生素D缺乏在该病的发生发展中起到了重要作用，补充维生素D可以减轻反复上呼吸道感染的疾病负担[2]。维生素D是一种脂溶性维生素，几乎所有的免疫细胞上都有维生素D受体，通过与受体结合，维生素D可以发挥免疫调节作用。Hcap18是LL-37的前体肽，Hcap18相关基因的启动区域有多个维生素D受体反应原件(vitamin D receptor element，VDRE)，维生素D与受体结合形成的二聚体，通过VDRE可以上调LL-37的表达[3]。而LL-37具有抗感染作用，在反复上呼吸道感染患儿中含量下降，与其发病有关[4]。现代免疫学研究显示T淋巴细胞在反复上呼吸道感染的发病及进展中起到了关键作用[5]，T细胞可分为Th1、Th2两类。IL-10是Th2细胞分泌的细胞因子，具有抗炎作用。体外小鼠实验中，烫伤后小鼠补充维生素D，可以促进抗炎因子IL-10的产生及释放[6]。同样，体外试验中，将LL-37加入活化的胎盘衍生的间充质基质细胞中，可以增强T细胞增殖，从而刺激IL-10等炎性因子的释放[7]。因而维生素D的免疫调节作用有可能与LL-37、IL-10有关，课题组为了寻找这其中的关联特设计本研究。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 入组标准

(1)1年以内发生上呼吸道感染次数超过正常范围，即0～2岁大于7次/年、2～5岁大于6次/年、5～14岁大于5次/年[8]。(2)不存在免疫缺陷、耳部及鼻部发育异常、呼吸道慢性疾病等基础疾病。

1.1.2 分组

2017年5月至11月到河北大学附属医院门诊就诊反复上呼吸道感染并存在维生素D缺乏患儿中，随机抽样选择64例患儿，随机分成2组，2组在年龄、性别等方面构成比例差异无统计学意义。实验组给予常规联合维生素D治疗，对照组给予常规联合感官上相似的安慰剂治疗，随访12个月，检测治疗前基线含量和治疗12个月后血浆25-羟维生素D3含量、血清IL-10含量及痰上清LL-37的变化。仅有61例完成了随访，实验组失访1例，对照组失访2例。随访期间，间隔3个月左右随访1次，定期检测患儿25-羟维生素D3含量。

1.2 方法

1.2.1 治疗方案

维生素D缺乏的诊断标准及治疗方案参考《儿童微量营养素缺乏防治建议》[9]。反复上呼吸道感染诊治原则参考中华医学会儿科学分会呼吸学组于2008年制定的《反复呼吸道感染的临床概念和处理原则》[10]。

1.2.2 标本采集

血标本的采集及保存：在空腹状态下采静脉血，标本保存于普通生化管(红帽或黄帽管)中，血清IL-10标本采用-80 ℃保存，25-羟维生素D3标本避光保存。

痰上清的采集及制作：清晨患儿进食或吃奶前，用无菌生理盐水清洁口腔后，用4%高渗氯化钠溶液雾化吸入15 min后叩击患儿肺部，然后负压吸引下于声门下部吸取痰标本，用一次性无菌小瓶留取痰液。操作使用的负压吸引器、一次性吸痰管、消毒等物品均一致。痰液标本保存于4 ℃冰箱或保温桶，在1 h内处理，将培养皿中的痰液肉眼去除唾液及杂物后放置于振荡器上混匀后取1 mL于刻度离心管中，加入4倍质量的0.1%二硫苏糖醇(DTT)，置于37 ℃水浴箱5 min，吹打致黏液完全溶解，2 500 r/min离心10 min，上清液置于-80 ℃保存。

1.2.3 试验方法

25-羟维生素D3的检测：血清中25-羟维生素D3标本离心(3 500 r/min，10 min)后，取上清液置于干净的离心管中，低温运输和贮存(样本稳定性：室温1 d，4 ℃冷藏2 d，-80 ℃冷冻30 d)，送到北京和合医学诊断技术股份有限公司进行检测，采用液相-串联质谱法(LC-MS/MS)。

LL-37和IL-10：采用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测外周血血清抗菌肽LL-37，试剂盒采用进口LL-37专用试剂盒(批号3213K21，Hycult Biotech，荷兰)，按试剂盒说明书要求使用聚丙烯微量离心管，EDTA抗凝剂抗凝，皆-80 ℃超低温冰箱保存。IL-10的ELISA法检测试剂盒购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.2.4 统计学方法

王老常说：我就是对农牧业感兴趣。他理解和尊重知识分子，自己也很注意学习，在这方面的知识和见解，颇具专家水平。走进王部长的书房，他收藏的有关农牧业政策、技术方面的书籍，满满几大柜。1971年他赠我十几本大学程度的专业书，有些书上有很多他亲笔勾画的批注和校释。

2 结果

2.1 治疗前情况

开始治疗前实验组与对照组比较，25-羟维生素D3、LL-37、IL-10含量及呼吸道感染次数差异均无统计学意义(表1)。

表1 实验组、对照组治疗前情况比较

2.2 治疗1年后情况

治疗1年后，实验组与对照组比较，25-羟维生素D3、LL-37、IL-10含量均显著增高，其差异均有统计学意义；呼吸道感染次数显著下降，差异也有统计学意义(表2)。

表2 实验组、对照组治疗1年后情况比较

2.3 实验组治疗前后情况

与治疗前相比，实验组治疗1年后25-羟维生素D3、LL-37及IL-10均显著增高，呼吸道感染次数显著下降，其差异均有统计学意义(表3)。

表3 实验组治疗1年前后情况比较

2.4 实验组25-羟维生素D3、LL-37及IL-10之间的相关性

血浆25-羟维生素D3含量与痰上清LL-37含量呈正相关(r=0.582，P<0.05)(图1)；血浆25-羟维生素D3含量与IL-10含量呈正相关(r=0.415，P<0.05)(图2)；痰上清LL-37含量与血清IL-10含量呈正相关(r=0.614，P<0.05)(图3)。

图1 血浆25-羟维生素D3含量与痰上清LL-37含量呈正相关

图2 血浆25-羟维生素D3含量与血清IL-10含量呈正相关

图3 血清IL-10含量与痰上清LL-37含量呈正相关

3 讨论

反复呼吸道感染是儿科的常见疾病，特别是反复上呼吸道感染，具有反复发作的特点，耗费看护者较多精力和财力。该病与环境、免疫、营养、感染等多种因素有关，维生素D缺乏是其中一个发病因素。维生素D是一类物质的总称，主要包括维生素D2和维生素D3，以维生素D3为主要形式。维生素D在肝脏进行第一次羟化，转化为25-羟维生素D，这是维生素D的主要储备形式，在血液循环中较为稳定。之后在肾脏进行第二次羟化，形成1，25-羟维生素D，这是维生素D发挥活性的主要形式。因此，一般通过检测血浆25-羟维生素D3含量来了解人体内维生素D的含量。

LL-37是一种重要的抗感染因子，IL-10是常见的抗炎因子，在感染性疾病中均有重要作用。上述研究显示维生素D与两者均存在密切关系，而反复上呼吸道感染作为小儿常见的感染性疾病，与维生素D、LL-37、IL-10的关系尚不明确。因此课题组对此开展了研究。

本研究设置实验组与对照组，实验组在常规治疗上加入补充维生素D方案，对照组仅给予常规治疗加安慰剂。两组的基线情况比较，差异无统计学意义，治疗随访1年后比较2组25-羟维生素D3含量、血清IL-10含量及痰上清LL-37含量，实验组均较对照组明显增高；而上呼吸道感染发生次数，实验组较对照组明显减少。这说明补充维生素D有助于改善反复上呼吸道感染病情，与之前的研究结果相同[18]。而且2组LL-37及IL-10差异有统计学意义，说明补充维生素D后可以促进LL-37和IL-10的产生。由于这2种物质均具有抗感染作用，因此，推测维生素D对呼吸道感染的治疗作用可能与他们有关，这在以往的研究中涉及较少。

实验组治疗随访1年后发现，25-羟维生素D3含量、血清IL-10含量及痰上清LL-37含量均有显著增加，上呼吸道感染次数显著减少。进一步进行维生素D、LL-37和IL-10的相关性分析，发现三者互相之间均存在正相关。这一发现与国内外他人研究[16-17]也有共同之处。而且这些结果均与前期背景调查相一致。根据目前试验结果，考虑维生素D对反复上呼吸道感染的治疗作用，与维生素D促进抗感染因子LL-37、IL-10的产生有关。但翻阅文献，目前关于LL-37与IL-10的相关基础研究较少，这也是今后研究的一个方向。