养殖虾塘常见耐药菌的分离鉴定与耐药基因检测

叶繁，冯时欢，吴佳佳, ，戴志远,

1. 浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2. 中国计量大学生命科学学院，浙江 杭州 310018；3. 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310012

抗生素滥用不断诱导细菌对抗生素产生抗性，目前，抗生素耐药基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）已成为难以降解的新型环境污染物。ARGs能在环境中长期残留，并在细菌菌群间迁移，同时可能通过直接接触或食物链污染等多种途径进入人体，增加人体的抗生素抗性，使细菌感染性疾病的治疗更加棘手（崔泽林等，2011）。中国水产养殖中抗生素滥用问题普遍，加之水体中抗生素本底水平较高，进而使水产养殖环境中ARGs的检出率不断增加，一些水产养殖动物携带ARGs也被不断检出（黄志坚等，2012）。

喹诺酮类抗生素和大环内酯类抗生素是目前中国对虾养殖业中常用的两类抗生素。王敏等（2011）在滨海典型养殖区的不同养殖水环境中采集样本，从中检测出了3类7种抗生素残留，其中，喹诺酮类药物诺氟沙星在虾池的检出量最高，为3.54 ng·L-1。郭鹏（2009）对44株水产源嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）进行药敏试验，发现环丙沙星、恩诺沙星抑菌率分别达97.67%、97.67%。葛铮（2015）从淡水鱼类中分离获得维氏气单胞菌（Ae. veronii），测定最小抑菌浓度，结果表明分离的维氏气单胞菌对庆大霉素、阿莫西林、红霉素全部耐药；对环丙沙星、恩诺沙星的耐药率分别为78.85%、57.69%。Vaseeharan et al.（2008）在印度对虾养殖场采集的细菌中发现有47.4%的细菌对红霉素敏感。中国水产养殖环境中ARGs的污染情况正愈发严重，并呈现多元化、复杂化的局面（张骞月，2016），着手水产环境 ARGs污染研究，对指导抗生素科学、合理使用，控制水产养殖动物中ARGs污染并阻止其通过食物链迁移至人体、保障水产食品安全意义深远。

本研究以杭州萧山地区南美白对虾养殖环境的微生物为研究对象，利用抗性平板进行抗生素抗性细菌初步筛选；借助16S rDNA序列分析技术探究分离菌株的分类信息；同时，对分离菌株 ARGs进行PCR扩增检测。研究结果可为掌握水产养殖区中ARGs的污染现状、了解其对养殖系统生态环境的影响、评估ARGs带来的生态风险提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

水样和泥样采集于杭州市萧山围垦某养殖厂的1号虾塘和2号虾塘，样品置于无菌自封袋中，低温（冰浴）运回实验室，置于4 ℃冰箱中保存，并在24 h内进行微生物分离实验。1号塘为露天养殖塘；2号塘为大棚养殖塘（该塘蓝藻爆发，水体富营养化）。

2216E培养基（青岛海博生物技术有限公司）；琼脂糖（Agarose，北京沃比森科技有限公司）；诺氟沙星（Norfloxacin）、红霉素（Erythromycin）购自上海阿拉丁生化科技有限公司；细菌基因组DNA小量提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）。

1.2 耐药菌的培养与计数

取20 g泥样（或20 mL水样）溶于含180 mL 0.85%无菌生理盐水。梯度稀释后分别涂布于2216E琼脂平板、含诺氟沙星（16 mg·L-1）2216E琼脂平板和含红霉素（8 mg·L-1）2216E 琼脂平板上，30 ℃培养48 h，分别对3种平板上的细菌数量进行计数。

1.3 菌株纯化

从上述诺氟沙星和红霉素抗性平板上随机挑选菌落形态有明显差异的菌株进行两次划线纯化培养，并将第二次分离纯化后的单菌落接种到含 5 mL 2216E液体培养基中，30 ℃培养48 h，获得新鲜菌液，取一定量新鲜菌液与等体积70%无菌甘油混合后于-80 ℃冻藏，备用。

1.4 细菌DNA提取

取新鲜菌液3 mL，按照细菌基因组DNA小量提取试剂盒说明书操作步骤进行细菌DNA提取和纯化。采用Nanodrop MN-913超微量分光光度计测定提取 DNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

表1 扩增引物序列Table 1 Primers for ARGs amplification

1.5 ARGs PCR扩增

以细菌基因组DNA为模板，采用25 μL反应体系进行 PCR 扩增。反应体系：2.5 μL 10×LA buffer(Mg2+plus)，2 μL dNTP Mix（2.5 mmol·L-1），引物各 1 μL，0.2 μL LA Taq（5 U·μL-1），1 μL DNA 模板，17.3 μL ddH2O。引物序列见表1。

反应条件：

（1）gyrA：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸5 min。

（2）ermB：93 ℃预变性3 min；93 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳验证后，随机挑取部分阳性扩增产物送至南京金斯瑞生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行同源性比对。

1.6 16S rDNA PCR扩增

以细菌基因组DNA为模板，参考袁开等（2017）方法完成16S rDNA的扩增。50 μL反应体系：5 μL 10×LA buffer（Mg2+plus），4 μL dNTP Mix （2.5 mmol·L-1），引物各 3 μL，0.3 μL LA Taq（5 U·μL-1），1 μL DNA模板，33.7 μL ddH2O。扩增产物送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行序列测定，测序结果在 NCBI数据库中进行同源性比对，并基于MEGA 5.1软件构建耐药菌的系统进化树（Saitou et al.，1987；Felsenstein，1985；Tamura et al.，2004；Tamura et al.，2011）。

1.7 数据处理及分析

运用Origin 2017进行数据统计分析并作图；运用 MEGA 5.1进行进化树构建，采用最大似然法（maximum composite likelihood method）和邻接法（neighbour-joining method）构建进化树，Boostrap值为1000。

2 结果与分析

2.1 养殖虾塘中耐药菌的分布

4个采样点细菌总数统计结果表明，2号泥样中可培养菌落总数最高，为 1.1×107CFU·mL-1，1号水样可培养菌落总数最低，为2.0×105CFU·mL-1。如图1所示，4个采样点均存在耐红霉素细菌，而耐诺氟沙星细菌只存在于底泥样品中。虽然水样细菌在诺氟沙星抗性平板上未出现菌落，但不能完全代表虾塘中不存在耐诺氟沙星细菌，由于实验室培养条件并不能完全模拟虾塘生长环境，许多环境细菌并不能在人工培养条件下生长繁殖。养殖虾塘细菌对红霉素耐药率较高，且耐红霉素细菌数比耐诺氟沙星细菌数高1－2个数量级。1号和2号虾塘泥样细菌对诺氟沙星的耐药率分别为0.36%、0.82%；1号虾塘泥样和水样中细菌对红霉素的耐药率分别为23.33%、18.50%，2号虾塘泥样和水样中细菌对红霉素的耐药率分别为20.00%、12.50%。

图1 养殖虾塘中菌落总数及抗生素耐药率Fig. 1 Total number of colonies and antibiotic resistance rate of the bacteria in shrimp ponds

2.2 ARGs PCR检测

4个采样点均存在耐红霉素细菌，而耐诺氟沙星细菌只存在于底泥样品中。在 6个抗性平板上分别挑选10株菌进行分离培养，即20株耐诺氟沙星菌株和40株耐红霉素菌株，共计60株。采用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA，并以其为模板进行耐药基因的PCR扩增。

60株菌株耐药基因PCR检测结果显示，在16株菌株中检出gyrA基因，在30株菌株中检出ermB基因，片段大小与预期扩增片段大小一致（见图2、图 3）。

图2 部分菌株ermBPCR产物电泳图Fig. 2 PCR amplicons of ermB

两种ARGs检出率如下：喹诺酮类ARGs gyrA基因的检出率为26.67%，大环内酯类ARGs ermB基因的检出率50.00%。另外按虾塘分类，1号虾塘gyrA基因的检出率较高，为43.33%；ermB基因的检出率较低，为30.00%；2号虾塘gyrA基因的检出率为10.00%，ermB基因的检出率为70.00%。

图3 部分菌株gyrA PCR产物电泳图Fig. 3 PCR amplicons of gyrA

2.3 菌株鉴定结果

随机挑取阳性扩增产物菌株进行鉴定，结果如表2。

Blast比对结果显示，所得21个16S rDNA基因序列与 Genebank核酸数据库中已有序列相似性达 99%－100%，具体鉴定结果如下：南极适冷菌（Rheinheimera sp.）7株、不动杆菌（Acinetobacter sp.）6株、微杆菌（Microbacterium sp.）3株、厦门希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）2株、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）2株、豚鼠气单胞菌（Ae. caviae）1株。1号虾塘共鉴定出2个属，66.67%为不动杆菌属，33.33%为微杆菌属；2号虾塘共鉴定出3个属，3个种，其中南极适冷菌最多，占58.33%，其余包括厦门希瓦氏菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌。耐药基因PCR产物测序结果经Blast比对分析后表明，1号虾塘中所测菌株扩增出的gyrA基因序列与约氏不动杆菌（Ac. johnsonii）的相应耐药基因序列的相似性均为97%；而2号虾塘中所测菌株扩增出的 gyrA基因序列与奥奈达希瓦氏菌（Sh. oneidensis）相应的耐药基因序列的相似性均为97%，2号虾塘中挑取的ermB基因序列均与酿脓链球菌（St. pyogenes）相应的耐药基因序列相似度最高（99%－100%）。

2.4 16S rDNA系统进化分析

从Genebank选取模式菌株16S rDNA序列，与21株测序菌株的16S rDNA序列共同构建系统进化树，结果见图 4。获得的菌株分布于变形菌门和放线菌门2个门级分类单元中，除菌株1-4、1-5、1-8与放线菌门的Microbacterium aureliae遗传距离较近外，其余菌株均聚类于γ-变形菌纲。2号虾塘大部分菌株的遗传特征比较接近，菌株2-1、2-3、2-5、2-6、2-7、2-8、2-10与Rheinheimera soli的系统发育关系最密切；1号虾塘多数菌株与 Ac. johnsonii聚为一簇。

表2 菌株鉴定结果Table 2 Bacterial typing and identification

3 讨论

本研究发现，虾塘泥样中菌落总数及耐药菌总数均高于其对应水样中的数量，这是因为虾塘中细菌数量主要决定于有机物的浓度（刘国才等，2000）；而在养殖池塘系统中，大量残饵、生物代谢物、生物残体等有机物不断沉积在池底，使得底泥环境更有利于细菌繁殖生长（李烁寒等，2009）。Gao et al.（2012）通过对天津市6个水产养殖场中的四环素类抗性基因和磺胺类抗性基因及抗性菌株进行检测，发现底泥中抗药细菌数量和抗生素抗性基因浓度都远高于水中，说明沉积物可能是抗性细菌和抗性基因的重要储存库。

已有研究报道指出，在水产养殖场的动物体内和环境中发现多重抗药菌株的存在。Novick（1981）指出在动物养殖业中使用亚治疗剂量的抗生素会促进产生多重抗药性菌株。Tendencia et al.（2001）在菲律宾的一个虾塘中发现与未使用过抗生素的池塘相比，使用过恶喹酸的虾塘里出现交叉耐药现象的菌株更多。本研究基于PCR检测耐药菌株中的耐药基因，也发现1号虾塘和2号虾塘中各存在2株菌株出现交叉耐药现象。

对虾塘中分离耐药菌鉴定结果显示，1号、2号虾塘中分布的耐药细菌种类不尽相同。其中，1号虾塘耐药菌以不动杆菌为主，2号虾塘中南极适冷菌所占比例最高，其次为希瓦氏菌属和气单胞菌属。不动杆菌、希瓦氏菌、嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌为致病菌，容易引起细菌性疾病，在机体免疫力下降时还会引起人体胃肠道、肺部等部位感染，微杆菌和南极适冷菌的致病性尚未明确。嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌是对虾养殖中的常见条件致病菌，容易引起红腿病、烂鳃病、败血病等（徐晓津等，2001）。气单胞菌利用能量的能力较强，当水体富营养化后，就会优先利用有机物进行繁殖，从而抑制其他细菌的繁殖，使水体中物质循环受到阻碍（罗璋，2007）。采样期间 2号虾塘正值蓝藻爆发，水体处于富营养化状态，这可能是其中气单胞菌较1号虾塘多的原因。

图4 基于16S rDNA序列的系统进化树Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

本研究鉴定的细菌最终归属于2个纲5个属，其中γ-变形菌纲数量最多。Nair et al.（2012）研究发现，变形菌门和厚壁菌门是河水、海水以及海洋底泥中的主要类群。窦研等（2015）也发现在中国渤海和黄海等地海水养殖池塘的沉积物中，优势菌群为变形菌门和厚壁菌门。2号虾塘多数菌株与Rheinheimera soli的模式菌株NR_044294.1聚为一簇；1号虾塘多数菌株与Ac. johnsonii的模式菌株MK294307.1聚为一簇。从聚类分析结果看出，来源相同的多数菌株聚为一类，两个虾塘的抗性菌种有较大差异，这可能是因为露天养殖和大棚养殖水体营养差异造成了抗性菌菌群分布各异。两个虾塘检出的 gyrA基因序列分别与约氏不动杆菌和奥奈达希瓦氏菌相应的耐药基因序列有很高的相似性（97%），而 ermB基因序列均与酿脓链球菌相应的耐药基因序列一致（99%－100%）。不同种属的耐药细菌，其携带的耐药基因存在高度的相似性，这也说明ARGs水平转移、传播可能普遍发生在不同细菌之间。高盼盼等（2009）指出，抗生素在水产养殖业中的滥用不仅会引起水生动物体内的抗生素残留，而且在使用过程中未被水生生物吸收的抗生素以及随水生生物粪便排泄的抗生素和穿过网箱未被生物食用的饲料中的抗生素最终溶入海水或随悬浮物沉降汇集于底部沉积物。残留在生物体内和进入环境中的抗生素会在养殖生物的肠道细菌内和环境细菌内诱导产生携带抗性基因的抗药菌株，经过质粒的水平转移等机制将ARGs传播给其他的细菌。

4 结论

通过对养殖虾塘中耐药细菌分离鉴定及 ARGs的检测分析，初步了解虾塘养殖环境中诺氟沙星和红霉素两种抗生素耐药菌的种类及其耐药基因污染情况。养殖虾塘底泥和水体中均存在一定比例的耐药菌，其中，虾塘底泥和水体中红霉素耐药细菌的比例均高于 10%，且多数耐药细菌携带相应的ARGs。不同养殖模式虾塘中耐药细菌分布存在差异，水体富营养化虾塘中致病性气单胞菌属细菌数量较多；而健康养殖环境中，不动杆菌和微杆菌等土著细菌携带ARGs比例也较高。由于ARGs在不同种属细菌间水平迁移的概率较高，因此，掌握养殖环境中ARGs污染现状，对制定科学、合理的抗生素使用方案、减少ARGs在不同细菌、生境中的传播扩散具有重要意义。