留兰香油的化学组成及其抗氧化、抗菌性能的测定

张曜 / 必维申美商品检测（上海）有限公司

0 引言

留兰香（Mentha spicata L.）是重要的药用植物，属唇性科薄荷属植物，具有强烈的芳香气味，异名绿薄荷。留兰香的化学组成主要包括香芹酮、柠檬油精、二氢黄蒿萜酮、樟脑萜、乙酸二氢香芹酯和β-石竹烯。这类挥发性油由于其独特的香味和风味被广泛应用于食品、药品及化妆品。

1 留兰香油的功效

1.1 天然抗氧化剂

抗氧化剂是一种能延长油品氧化反应的诱导剂，减缓油品氧化速度，延长油品使用寿命的抑制剂。它是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。现在，即使有许多可以抑制氧自由基反应发生的人工合成的抗氧化性物质，由于安全性和潜在的毒性作用等方面的欠缺，合成抗氧化剂的使用越来越多地受到限制。因而，近年来从天然植物中探索或寻找安全性更高的天然抗氧化物质，引起了许多学者的关注[1]。

1.2 天然抗菌剂

抗菌剂，是指一类用来防治各类病源微生物引起植物病害的药剂，对病原微生物有杀死作用或抑制生长作用。常见的抗菌剂都是一些化工产品，如果直接运用于人们的日常生活将对身体产生一定的危害。留兰香油作为天然的植物提取物抗菌剂，将受到消费者的日益青睐。

1）微生物的培养温度

不同菌种所适合的培养温度都不一样，有些温度适合细菌、真菌生长，有些则抑制其生长，更可能会导致菌的死亡。细菌一般适宜温度是37 ℃，霉菌与酵母的一般培养温度则为27 ℃左右。

2）微生物的培养基

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。测最小抑菌浓度（MIC），由于是在96 孔板中测试，故所需培养基是液体培养基。而在测最小杀菌浓度（MBC）时，由于使用的是涂布平板法，故需要的是固体培养基，但所有的培养基也必须适合所培养的微生物，所以最终选用了适合菌种生长的培养基：大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和适合真菌用培养基：马铃薯液体培养基、改良马丁琼脂培养基。

1.3 平板连续稀释法与微量稀释法

目前大多数的药物敏感试验使用的是微量稀释法和纸片法。两种方法各自存在优缺点，纸片法价格便宜、操作简便、抗生素选择灵活，但是纸片法只是定性试验，且只能用于测试快速生长的细菌；而微量稀释法虽价格较昂贵，但操作简便，所以选用微量稀释法来测定最小抑菌浓度。

涂布法接种是一种常用的接种方法，不仅可以用于计算活菌数，还可以利用其在平板表面生长形成菌苔的特点用于检测化学因素对微生物的抑杀效应，所以选用平板涂布法来测定最小杀菌浓度。

2 材料和方法

2.1 材料

留兰香油（薄荷油），上海苹果香精香料有限公司；乙醇，中国医药（集团）公司；二甲基亚砜（DMSO），中国医药（集团）公司；吐温80，中国医药（集团）公司；胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤(培养基)TSB，中国医药（集团）公司；大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA），中国医药（集团）公司；改良马丁琼脂培养基，中国医药（集团）公司；DPPH，日本东京化成工业株式会社；铁氰化钾，中国医药（集团）公司；MTT（氯丁胶新型交联剂），Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密苏里州，美国） ；INT（碘硝基四唑紫溶液），Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密苏里州，美国）；胎牛血清（FBS），Invitrogen（USA）；高纯氦气，上海彭浦液化空气有限公司。

2.2 仪器和设备

GC-MS，5973N，安捷伦科技，美国 ；气相色谱柱，HP-5，安捷伦科技，美国；

LRH-250 全自动新型生化培养箱，上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-2D/2G 垂直流超净工作台，上海精密科学仪器有限公司；TS-200B 恒温培养振荡器，上海精密科学仪器有限公司；LDZM-80KCS-ii立式高压蒸汽灭菌锅，上海天美生化仪器设备工程有限公司；752N 紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；FA2104 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SB4200DT 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-S11-2-S 型电热恒温水浴锅，上海新苗医疗器械制造有限公司；CT14RD 台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司。

2.3 方法

2.3.1 化学组成的测定

留兰香油中薄荷醇的平均含量是Ruimin Lin 等用GC-MS 的方法测定而得。参考这个方法，用GCMS（气相色谱-质谱联用仪）来分析绿留兰香油的化学组成，其中气相色谱柱是采用HP-5 型号的毛细管色谱柱。柱温箱的起始温度控制在60 ℃，保持3 min，升温梯度以 3 K/min 升至 240 ℃，采用恒流模式，柱流量是 1 mL/ min，进样量是 0.2 μL，分流比是20 ∶1。质谱的离子源采用电子电离源，电子能量是70 eV，四级杆的温度是150 ℃，离子源温度230 ℃，电子倍增器的电压不高于2 200 V，质谱连接处的温度是250 ℃，溶积延迟3 min，质量数采集区间为：40～550。

2.3.2 抗氧化活性

2.3.2.1 DPPH 法

DPPH（2,2-联苯基-1-苦基肼基）检测方法通常要涉及氢原子转移反应，但是，考虑到动力学数据，一个电子的转移机制也已经建立了这个方法。绿留兰香油上的自由基的活性清除是根据分光光度法来测定的，它是通过计算减少DPPH 的乙醇溶液而得。

按照Williams 等人的方法，准确称取DPPH 试剂 0.039 4 g，用无水乙醇溶解定容至 100 mL 容量瓶中，得浓度为1 mmol/L 的DPPH 储备液，摇匀置于冰箱中冷藏备用。临用前用无水乙醇稀释至浓度为0.2 mmol/L 即可。分别取 1.5 mL 各浓度的留兰香油乙醇液置于不同的4 mL 比色管中，再加入1.5 mL，0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，待反应结束，同时需要在合适的温度下放在暗处60 min。然后分别测定各混合液在518 nm 处吸光值。每一个样品平行测三次，取平均值，测定DPPH 自由基清除率。

DPPH 溶液中抑制自由基的计算方法如下：

式中：Ablank—— 空白反应的吸光度；

Asample—— 测试样品的吸光度

用IC50表达抗氧化活性。IC50定义为抗氧化剂需要降低到最初DPPH 浓度的50%。实验结果是三个实验的平均值。

2.3.2.2 还原力的检测

绿留兰香油的还原力是用PRUSSIAN BLUE（普鲁士蓝）方法检测的。取1 mL 不同浓度待测样品于试管中，依次加入 2.5 mL 磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L PBS，pH 6.6）和 2.5 mL，1%六氰合铁酸钾溶液 [K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴保温20 min 后，快速冷却，再加入 2.5 mL，10% 三氯乙酸 (TCA)，以 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液 5.0 mL，依次加入 5.0 mL 蒸馏水，1.0 mL，0.1%的三氯化铁（FeCl3）溶液，充分混匀，静置10 min。反应混合物在700 nm 处测定其吸光值，以蒸馏水代替样品做空白对照，每一样品浓度平行测三次，取平均值。

2.3.3 抗菌活性的测定

2.3.3.1 菌种的制备

所用菌株在实验的前一天晚上，在37 ℃的条件下培养。选出典型的菌落接种到TSB 液体培养基，并在37 ℃条件下培养18 h。由于桔青霉菌和黑曲霉素是真菌，所以其培养温度是27 ℃。之后用平板细菌计数方法测定它们生长的混浊度，剩下的混悬液稀释至细菌群落总数在 1×105～ 1×106CFU/mL。如果是真菌，完整的细菌被孢子取代，故需挑起孢子来制成孢子混悬液。孢子混悬液的含菌量也稀释至1×105～ 1×106CFU/mL，用于 CBC 平板细菌计数方法[6]。

2.3.3.2 测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

在96 孔聚苯乙烯板中，加入100 μL 不同浓度的留兰香油，使用5%吐温80 作为溶剂，每孔依次加入 100 μL 培养基和 50 μL 菌液，测试油的最终浓度分别为（400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5）μL /mL。96 孔板，用胶带封好，以减少油挥发。并准备了阴性对照（含5%吐温80 的油和培养基）和阳性对照（只含5%吐温80 的微生物培养基）。细菌悬浮液的微孔板在37 ℃培养24 h，真菌混悬液须在27 ℃培养48 h。最后，在每个小孔中加入 40 μL 的 INT 溶液（溶解 INT，H2O ∶ C2H5OH 按1 ∶ 1 制成 50 mg/mL），测定最小抑菌浓度（MIC）。因为MIC 为样品细菌未能增长的最低浓度，所以在培养基中没有被检测到有明显的变化即可[7]。

为了评估最小杀菌浓度（MBC），在没有加入INT 的条件下重复上述实验。100 μL 没有被检测到有明显变化的被检液涂布到琼脂培养基平板上，观察其微生物的生长情况。细菌板在37 ℃培养48 h，而有真菌的须于27 ℃培养72 h。MBC 是细菌未能成长在这个平板上的最低浓度。所有的实验须平行测试三次。

2.3.4 细胞毒性的测定

绿留兰香油的海拉细胞有细胞毒性，可用MTT方法[8-10]检测。海拉细胞的接种方法是每5 000 个细胞接种到含有200 μL 生长培养基的96 孔板中，培养24 h，等到有80%的覆盖密度，才能用于检测。然后把原培养基用新鲜的无血浆培养基来代替，再放入连续稀释的不同浓度的绿留兰香油。细胞在孵育72 h 后需要把培养基换成新的生长培养基再加入20 μL 的 MTT。再需要培养 4 h，随后加入 150 μL 的DMSO，之后就可以在570 nm 处用酶标仪测定吸光度。细胞的活力度就是通过这些数据计算而得。

细胞的活力度通过下列公式计算而得：

式中：Atest—— 绿留兰香油中处理过的细胞的吸光度；

Acontrol—— 绿留兰香油没有处理过的细胞的吸光度

3 结果与结论

3.1 化学组成的测定

挥发性油已广泛应用于食品、化妆品和制药行业，因此，现在各种芳香植物挥发性油的生物活性研究已经是有吸引力的研究领域之一。这项研究评估了在中国研究留兰香油的化学成分和生物活性。通过面积归一化法，对留兰香油的主要挥发性物质进行了测定，留兰香油的GC-MS 分析结果列于表1。在研究留兰香油中被鉴定出的21 种化合物占总油的97.10%。挥发性油中主要成分是香芹酮（65.33%），柠檬油精（18.19%），二氢黄蒿萜酮（2.97%），樟脑萜（2.34%），乙酸二氢香芹酯（1.54%）和β-石竹烯（1.12%）。关于留兰香油成分的已发表的报道相对较少。

表1 留兰香油的化学成分

3.2 抗氧化活性的测定

3.2.1 DPPH 测试

留兰香油其潜在的抗氧化活性通过2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）测定方法来筛选。DPPH是一个稳定的自由基，可以很容易地发现一种抗氧化剂存在的减少。这表明在518 nm 有最大的紫外线和可见光（UV-VIS）吸光度。首先，得出了一个结论，留兰香油自由基的清除反应是在反应开始50 min 后稳定的（图1）。之后，使用不同浓度的留兰香油，以测试其DPPH 自由基清除能力并发现当浓度高于189.7 mg/mL 时，其清除自由基能力停止大幅增加，并保持在一个稳定的水平。所以，选择留兰香油浓度从27.1～189.7 mg/mL，以确定其准确的IC50。结果表明，在控制剂量和时间条件下，留兰香油能有效和快速地抑制DPPH 自由基的形成，表明有效的抗氧化剂活性（图2）。在这项研究中，留兰香油有去清除DPPH 自由基的能力是在浓度为50%抑制浓度（IC50）的基础上确定的。留兰香油的IC50值作为清除能力的评价指标，最终确定为72.07±0.34 mg/mL。

图1 加入留兰香油后抑制DPPH 自由基的变化，数据表示为平均值（N = 3）

图2 DPPH 自由基清除率和留兰香油的浓度之间的线性相关，数据表示为平均值（N = 3）

3.2.2 还原力的测定

通过在还原力的检测中，可以发现随着测试样品活性下降的增加使反应混合液的吸光度也增加（图3）。抗氧化化合物因为它们的还原能力导致铁（Fe3+）还原成亚铁（Fe2+）的形态。普鲁士蓝有色络合物的形成是由于加入的三氯化铁还原成亚铁（Fe2+）的形态。因此，通过测量在700 nm 处形成普鲁士蓝可以决定是否具有还原性。在这个实验中，试验溶液由黄色改为绿色或蓝色取决于抗氧化样品的还原力。吸光度较高表明较高的还原能力。留兰香油的浓度从27.1mg/mL 增加至189.7 mg/mL 显示较大的剂量反应的效果。上述结果表明，作为一种有效的天然抗氧化剂，留兰香油值得更多的研究。

图3 吸光度和留兰香油的浓度之间的线性相关，数据表示为平均值（N = 3）

3.3 抗菌活性的测定

3.3.1 留兰香油的抑菌效果

由表2 可以看出，留兰香油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、桔青霉素、黑曲霉素都具有一定的抑制作用，但抑菌作用的大小不同，其顺序为：酿酒酵母＞大肠杆菌＞桔青霉素＞黑曲霉素＞金黄色葡萄球菌。

3.3.2 留兰香油的最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）

通过留兰香油抑菌和杀菌浓度的测定，获得抗菌性能的精确数据。表2 显示了他们对5 种微生物测试的最低抑菌浓度（MIC；μL/mL）和最低杀菌浓度（MBC；μL/mL）。表2 显示，留兰香油对所有被测试微生物有抑菌和杀菌效果。

它对于抗大肠杆菌、啤酒酵母和桔青霉素是非常有效的。啤酒酵母对留兰香油较为敏感（MIC 0.781 25 μL/mL）。MBC 的评价也发现了类似的结果。Aggarwal 和其他人（2002 年）对留兰香（主要成分是柠檬27.3%和56.6%香芹酮）从隔离油成分的抗菌活性进行了评估。香芹酮被测试出抗广泛的人类致病真菌和细菌。因此，留兰香油的抗菌活性高，可能是由于香芹酮含量高。但是Aggarwal 和其他人（2002）没有评价香芹酮对啤酒酵母的抗性。

表2 留兰香油的最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）/μL·mL-1

4 结语

植物次生代谢产物，一般显示了显著的生物活性，如抗氧化、抗菌。而留兰香油的应用领域无疑可以扩大，如它显示的生物活性。因此，用GC-MS和常见的实验方法研究绿留兰香油的化学成分，然后评估其生物活性，包括抗氧化、抗菌。结果可提供给食品、化妆品和制药行业使用的绿留兰香油其潜在的抗氧化、抗菌性能。许多植物精油对病菌具有抑制作用，且有许多都已经被开发利用作为天然的防腐剂，但不少都是粗制品，其中的有效成分含量不稳定，有时会随着环境及季节的变化而改变，所以该研究也为探索或寻找安全性更高的天然防腐剂、天然抗氧化物质提供了重要的依据。