聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯生物降解膜对土壤氨氧化和反硝化微生物变化的影响

林 青，曾 军，王 斌，史应武，杨红梅，张 涛，高 雁，楚 敏，王金鑫，孙九胜，霍向东

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091;2.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】 聚乙烯地膜具有防除杂草、保墒、增温、提高作物产量及品质等作用且价格低廉，我国已成为世界上地膜用量最多、覆盖面积最大、覆盖作物种类最多的国家[1]。传统聚乙烯地膜在自然环境中极其不易被分解，伴随着地膜覆盖使用年限的增加和残膜回收率低土壤中残膜量逐步增加，已造成严重的白色污染[2,3]。可降解地膜已在农业生产中大量应用，已成为传统地膜的理想替代品[4-6]。【前人研究进展】赵彩霞[1]、唐薇[8]、朱友娟等[9]研究表明，一些生物降解地膜产品与传统地膜在增温、保墒及棉花产量方面的差异不显著。胡宏亮[10]、石凤兴等[11]研究表明，部分生物降解膜的保温性能接近普通地膜，且在作物生长发育与产量方面优于普通地膜。林萌萌等[12]研究表明，部分生物降解地膜能达到与普通地膜相似的保温保墒效果，在提高叶绿素含量，叶片净光合速率，延缓叶片衰老方面优于普通地膜处理。Touchaleaume[13]研究显示四种PBAT生物降解膜与PE膜相比，葡萄藤生长量和葡萄产量没有显著差异。氨氧化作用是土壤硝化作用的限速步骤，是氮循环过程的关键环节,氨氧化过程的产物硝酸盐通过反硝化作用还原为一系列氮氧化气体和氮气，进而导致土壤氮素的损失及温室气体排放增加。地膜覆盖对土壤耕层氮素含量的增加及减少N2O的排放具有积极作用[14,15]。【本研究切入点】PBAT生物降解膜对土壤中氮循环相关微生物的影响不是十分清楚。研究聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯生物降解膜对土壤理化性质及氮循环相关微生物的影响。【拟解决的关键问题】通过研究氨氧化细菌和氨氧化古菌(amoA基因)及反硝化(nosZ基因)功能微生物丰度、群落结构及多样性的影响，分析PBAT生物降解膜对土壤中氮循环微生物的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

于新疆农业科学院拜城试验站铺覆(Polyethylene)PE膜(市售)和PBAT生物降解膜(新疆康润洁环保科技有限公司)的番茄、玉米、甜菜、花生、马铃薯。以及岳普湖县岳普湖乡铺覆PE膜和PBAT生物降解膜的棉花各667 m2，在作物收获前且两种薄膜都有破损的情况下每个处理3点土柱法采集0～30 cm耕作层土，新鲜土样冷藏运回实验室进行后续试验。

1.2 方 法

1.2.1 土壤基本理化性质1.2.2 土壤DNA提取和实时定量PCR

称取0.5 g新鲜土样，按照PowerSoilTM试剂盒(MoBio Laboratories)方法,提取土壤DNA，100 uL洗脱，Epoch微量测定DNA的浓度和纯度。DNA样品存储在-20℃，用作下游分子实验的模板。 AOA-amoA、AOB-amoA 和nosZ 基因的定量测定在LightCycler® 480荧光实时定量PCR仪(Roche Diagnostics Ltd.Switzerland)上完成，列出使用的引物和扩增条件。 采用SYBR GREEN作为荧光标记，反应体系为20 μL，包含10 μL 2X TB Green Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)(Takara Biotechnolgy，Japan)，模板DNA 2 μL，引物各0.4 μL(10 μM)，其余用灭菌双蒸水补足。用于标准曲线的质粒制备和提取参照之前文献中发表的方法[16]，10倍连续稀释的质粒用于构建定量PCR标准曲线，所有基因的扩增效率均保证在85%～98%，利用溶解曲线检测扩增的特异性。表1

表1 PCR所用的引物序列和反应条件
Table 1 Primer sequences and reaction conditions used by PCR

amoA-1F+amoA417R用于AOA-amoA基因，nosZ-F+nosZ2R用于nosZ基因的T-RFLP分析

1.2.3 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)

末端限制性片段长度多态性(Terminal restrictiction fragment length polymorphism,T-RFLP)利用6-carboxyfluorescein(FAM)荧光标记正向引物的5’末端，目标基因经PCR扩增后被标记，选取适当的限制性内切酶酶切后产生长度不等的DNA片段，经毛细管电泳分离，荧光检测后产生不同长度大小及荧光强度的图谱，通过对不同样品图谱间波峰的比较，可得到各功能基因群落结构和多样性在处理间的差异[17，18]。土壤DNA的PCR扩增采用表1所列引物，其中FAM荧光标记引物用于T-RFLP的研究。PCR产物用Wizard SV Gel and PCR Clean纯化试剂盒(Promega，USA)纯化。AOA-amoA和nosZ基因采用的内切酶是HhaⅠ(Takara Biotechnology，Japan)，AOB-amoA基因采用内切酶MspⅠ(Takara Biotechnology，Japan)[19，20]。 反应体系为20 μL，包括酶(4U)和DNA样品(约500 ng)，在37℃酶切3 h。 反应产物送至上海生工进行检测。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 PBAT可降解膜与PE膜对土壤理化性质的影响

研究表明，在铺覆的地膜崩解期，同种作物(除棉花外，棉花两种铺覆实验地基础条件差异较大)铺覆PBAT生物降解膜与PE膜的土壤pH、总盐、有机质、速效氮、速效磷、速效钾等理化性质之间。表2

表2 铺覆PBAT可降解膜与PE膜土壤的理化性质
Table 2 Physical and chemical properties of coated PBAT degradable membrane and PE membrane soil

处理TreatmentpH总盐Totalsalt(g/kg)有机质Organicmatter(g/kg)速效氮Availablenitrogen(mg/kg)速效磷Availablephosphors(mg/kg)速效钾Availablepotassium(mg/kg)含水量Watercontent(%)番茄PE(T.PE)8.222.35.29103.752.020315.76番茄PBAT(T.PBAT)8.212.05.0797.442.218314.91玉米PE(C.PE)8.012.74.90118.761.720617.37玉米PBAT(C.PBAT)7.994.04.39161.340.320116.14甜菜PE(Sb.PE)7.962.26.21184.2152.022317.71甜菜PBAT(Sb.PBAT)7.952.36.44172.4183.322811.56花生PE(Pn.PE)7.883.25.40154.2176.627712.99花生PBAT(Pn.PBAT)8.022.96.06146.3176.229612.58土豆PE(P.PE)7.962.84.75144.0115.917414.38土豆PBAT(P.PBAT)8.013.05.14145.6125.418213.39棉花PE(Cot.PE)8.309.57.1734.7318.79018.39棉花PBAT(Cot.PBAT)8.601.76.8866.5312.76918.06

注：番茄PE(tomato PE,T.PE),番茄PBAT(tomato PBAT,T.PBAT);玉米PE(corn PE,C.PE),玉米PBAT(corn PBAT,C.PBAT);甜菜PE(sugar beet PE,Sb.PE),甜菜PBAT(sugar beet PBAT,Sb.PBAT);花生PE(peanut PE,Pn.PE),花生PBAT(peanut PBAT,Pn.PBAT);土豆PE(potato PE,P.PE),土豆PBAT(potato PBAT,P.PBAT);棉花PE(cotton PE,Cot.PE),棉花PBAT(cotton PBAT,Cot.PBAT)。下同(the same as below)

2.2 PBAT可降解膜与PE膜对氨氧化和反硝化功能基因丰度的影响

研究表明， AOA-amoA基因扩增效率为86%，AOB-amoA基因的扩增效率为95%，nosZ基因扩增效率为95%。实时荧光定量PCR测定六种作物铺覆两种不同薄膜情况下的土壤古菌氨氧化基因AOA-amoA、细菌氨氧化基因AOB-amoA及反硝化微生物nosZ基因的丰度。AOA-amoA基因丰度范围为每克干土(1.56×107～1.04×109)，其中番茄铺覆PE膜的基因丰度最高，棉花铺覆PBAT生物降解膜的基因丰度最低。AOB-amoA基因丰度范围为每克干土(2.15×106～2.20×109)，其中花生铺覆PBAT生物降解膜的基因丰度最高，棉花铺覆PE膜的基因丰度最低。nosZ基因丰度范围为每克干土(1.38×105～5.56×106)，其中番茄铺覆PBAT生物降解膜的基因丰度最高，花生铺覆PE膜的基因丰度最低。实验结果表明,同种作物铺覆PBAT生物降解膜与PE膜之间，AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因丰度无显著差异，而不同作物对AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因丰度的影响较为明显。图1

注：(A) 古菌氨氧化基因丰度；(B) 细菌氨氧化基因丰度；(C)氧化亚氮还原酶基因的丰度

(A) AOA-amoA gene abundance; (B) AOB-amoA gene abundance; (C) nosZ genes abundance

图1 古菌氨氧化基因、细菌氨氧化基因及反硝化微生物nosZ基因的拷贝数
Fig.1 Gene copy numbers of the AOA-amoA, AOB-amoA and nosZ.

2.3 PBAT可降解膜与PE膜对氨氧化和反硝化功能基因多样性的影响

研究表明，土壤AOA-amoA基因经过HhaⅠ酶切后，选取相对峰面积大于0.01的限制性末端片段(T-RFs)作为7个优势片段(A)，其中165、332、546、602和641 bp 5个T-RFs为拜城试验站5种作物的优势片段，546 bp的平均相对丰度达67.5%。而165、256、267和641 bp 4个T-RFs为岳普湖乡棉花的优势片段，256和267 bp为特有片段，641 bp的平均相对丰度高达89.7%。土壤AOB-amoA基因经过MspⅠ酶切后，得到相对峰面积大于0.01的 3个T-RFs分别为54、233和254 bp，为6种作物共有的优势片段(B)。其中233 bp为拜城试验站5种作物土壤的主要片段，其平均丰度达59.9%，而54 bp为岳普湖乡棉花的主要片段，平均丰度达82.5%。6种作物土壤的nosZ基因经过HhaⅠ酶切后得到5个相对峰面积大于0.01的优势片段T-RFs(C)。其中352 bp为拜城试验站5种作物土壤的主要片段，其平均丰度达41.5%，而50 bp为岳普湖乡棉花的主要片段，平均丰度达22.1%。

T-RFLP指纹图谱的解析中，在特定引物和内切酶的组合下，每一个T-RF可代表一个物种，氨氧化细菌和氨氧化古菌(amoA基因)及反硝化(nosZ基因)功能微生物在不同群落中的组成及比例的差异主要体现在作物品种和种植地域之间，而在铺覆PBAT生物降解膜和PE膜间没有显著差异。图2

图2 不同作物在铺覆PBAT生物降解膜和PE膜下土壤AOA-amoA(A)、AOB-amoA(B)和nosZ(C) 基因 T-RFs相对丰度
Fig.2 Relative abundance of T-RFs of AOA-amoA(A), AOB-amoA(B) and nosZ(C) in different crops under PE and PBAT membrane

将6种作物铺覆不同膜土壤中的氨氧化细菌、氨氧化古菌和反硝化功能微生物的群落多样性指数对比发现：在不同作物土壤中氨氧化古菌种类最为丰富，其群落的物种丰度S最高，在花生PBAT土壤中高达35.33，而氨氧化细菌群落最低，范围在2.67～7.33。多样性指数Shannon-Weiner指数H，Simpson指数D和物种均度E，在6种作物PBAT生物降解膜和PE膜之间较为均匀，差异不显著。与优势片段的群落特征类似，即4个多样性指数在作物品种间、种植地域间呈显著差异，而在铺覆不同地膜间无显著差异。表3

表3 不同作物在铺覆PBAT生物降解膜和PE膜下土壤AOA-amoA(A)、AOB-amoA(B)和nosZ(C) 基因多样性指数
Table 3 Diversity indices of AOA-amoA(A), AOB-amoA(B) and nosZ(C) in 6 crops under PE and PBAT membrane

处理Treatment氨氧化古菌Ammonia-oxidizingarchaea氨氧化细菌Ammonia-oxidizingbacteria反硝化微生物DenitrifyingmicrobiaSH'DESH'DESH'DE番茄PE8.671.020.530.487.331.200.570.637.331.730.780.94番茄PBAT20.331.130.540.416.001.040.500.599.001.890.790.93玉米PE17.001.010.470.362.670.550.300.5614.332.480.570.94玉米PBAT15.331.040.540.395.000.920.460.5714.002.370.890.90甜菜PE33.331.020.380.295.331.030.550.6212.332.270.870.91甜菜PBAT28.000.730.240.224.330.910.520.6710.001.930.780.85花生PE30.671.280.560.373.000.780.470.7114.002.360.880.90花生PBAT35.331.400.610.393.670.880.510.6913.672.390.890.92土豆PE26.671.160.540.384.001.010.560.7412.672.270.880.90土豆PBAT11.001.060.510.483.000.760.450.6913.672.290.870.91棉花PE6.330.720.320.396.501.100.490.589.672.010.830.89棉花PBAT9.501.270.520.546.500.830.360.4412.002.190.860.88

3 讨 论

土壤中的氨氧化和反硝化微生物是氮素转化功能的重要参与者，其数量和多样性与土壤生态系统氮循环密切相关。地膜覆盖会改变土壤的氮素循环过程，明显加速氮矿化速率，增加土壤氮素的含量[14，21，22]。张景俊等[23]研究显示,地膜覆盖仅对0～40 cm土层硝态氮有影响，覆膜120 d后,普通塑料地膜覆盖与生物可降解地膜覆盖处理差异逐渐变大。但研究中，崩解期同种作物铺覆PBAT生物降解膜与PE膜之间的土壤各理化指标差异不显著。不同生物降解膜与PE膜崩解的时间的差异可能是造成研究与已有研究结果不同的原因。尚书研究显示不覆膜、半覆膜和全覆膜三种覆膜方式对土壤中氨氧化微生物的群落结构和丰度有一定的影响[24]。研究中，同种作物铺覆PBAT生物降解膜与PE膜之间，AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因丰度与多样性无显著差异，但不同作物对AOA-amoA、AOB-amoA及nosZ基因丰度的影响较为明显。这与日本Akihiko Masui等[25]的研究结果：丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)和聚已酸内酯(PCL) 降解膜与PE膜对土壤细菌总量、细菌群落结构影响无差异，相一致。Anu Kapanen等[26]的研究结果也显示生物降解膜与PE膜对土壤中氨氧化细菌的群落多样性影响无差异。

4 结 论

通过对番茄等6种作物分别铺覆PBAT生物降解膜与PE膜后，测定了其土壤理化性质，用实时荧光定量和T-RFLP指纹图谱技术分析了土壤中重要的氮元素循环相关的氨氧化细菌、氨氧化古菌(amoA基因)和反硝化(nosZ基因)功能微生物的群落丰度、群落结构及多样性。结果表明，PBAT生物降解膜与PE膜对土壤理化性质、3种功能微生物的群落丰度、结构及多样性的影响无显著差异(P>0.05)，而作物的种类是造成差异的主要因素，即铺覆PBAT生物降解膜和PE膜不会对同种作物的土壤重要理化性质和氮循环相关功能微生物的群落产生显著差异(P>0.05)。基于PE膜造成的严重白色污染，可以考虑用PBAT生物降解膜替代传统PE膜。