伯氏疏螺旋体TaqMan-MGB 探针荧光定量PCR 方法的建立及对新疆地区蜱的检测

王 娅，叶 锋，刘丽娅，谢彩云，谷文喜，钟 旗，易新萍，古丽扎提·塔力甫汗，马晓菁

（1.新疆农业大学动物医学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830011）

莱姆病（Lyme disease，LD）是由硬蜱叮咬传播的一种自然疫源性人兽共患疾病，其病原体为伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）。伯氏疏螺旋体是一种微嗜氧的革兰氏阴性菌，生长缓慢，具有遗传多态性。目前，已发现伯氏疏螺旋体约有20种基因型，其中5 种为致病基因型。我国主要存在3 种致病基因型[1-3]，分别是阿弗西尼疏螺旋体（B.afzefii）、伽氏疏螺旋体（B.garinii）以及狭义伯氏疏螺旋体（B.burdorferi sensu stricto）。莱姆病呈世界性分布，在全球70 多个国家均有病例报告，年发病约30 万例，且有不断增多的趋势[4]。1982年以来，美国每年有近2 万新发病例，是美国最常见的节肢动物传染病。我国1986 年在黑龙江省海林县首次发现莱姆病，至今在30 多个省（直辖市、自治区）均有报道，已从其中的19 个省（自治区、直辖市）采集的样本中分离出病原体，证实我国存在莱姆病自然疫源地[5-7]。该病的发生和分布具有明显的地区性，与当地蜱的种类、数量及其活动周期密切相关。我国莱姆病高发地区主要包括内蒙古林区、西北林区和东北林区。生活在自然疫源地、有蜱活动林区的居民、工作者以及旅游者等，不论年龄、性别都可能感染莱姆病[8]。该病对人群的危害极大，不仅表现为皮肤损伤，也可造成神经系统损伤以及骨关节病，严重者终生残疾，甚至死亡[9]。动物被携带病原体的蜱虫叮咬后，可出现关节肿大、脑炎等一系列临床症状。莱姆病不仅对公共安全造成威胁，同时危害畜牧业发展。因此，建立伯氏疏螺旋体快速、准确的诊断方法，对莱姆病防控具有重要意义。

伯氏疏螺旋体的检测主要从病原体分离培养、血清免疫学以及核酸检测三个方面开展。分离培养并获得病原体是莱姆病诊断的“金标准”，有着不可替代的作用。但该方法耗时、培养条件苛刻、分离率低，在临床检测中逐渐被其他方法所替代。血清学检测方法常用的有间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及免疫印迹试验（Western Blot，WB）。但由于伯氏疏螺旋体抗原结构复杂，其血清学诊断存在很多缺陷[10]。近年来，伯氏疏螺旋体的分子检测以聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction，PCR）为基础的PCR 和荧光定量PCR（real-time PCR）应用最为广泛。荧光定量PCR 技术是在PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，通过荧光信号积累，获得检测结果，既有普通PCR高灵敏的特点，又有DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的优点[11]，因此在病原检测、检验检疫以及基础研究领域应用广泛。曹杰等[12]在我国首次报道建立了TaqMan 探针荧光定量PCR 方法并用于检测硬蜱中的伯氏疏螺旋体。本研究采用TaqMan-MGB 探针，以伯氏疏螺旋体16SrRNA 保守序列设计探针及引物，建立了伯氏疏螺旋体荧光定量PCR 检测方法，并用其对新疆3 个地区100 份蜱DNA 样本进行了检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 伯氏疏螺旋体标准株B31（ATCC35210）、大肠杆菌标准株（CVCC1531）、沙门氏菌标准株（CVCC3762）、钩端螺线体标准株（DSM21537）：新疆畜牧科学院兽医研究所保存。

1.1.2 检测样品 在新疆伊犁、克拉玛依、阿拉山口3 个地区采集蜱300 只。

1.1.3 主要试剂TaqProbe 2×qPCR Mix：购自abm 公司；PCR Mix：购自北京庄盟国际生物基因有限公司；PMD18-T 载体：购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司；微量DNA 提取试剂盒：购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器 实时荧光定量PCR 仪：Applide Biosystems QuantStudio 5

1.1.5 16SrRNA 标准质粒克隆引物 根据伯氏疏螺旋体16SrRNA 基因序列，应用Primer 5.0设计引物。上游引物16sA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTTAG；下游引物16sAR：TGATCCAGCCGCACTTTCCA。引物由昆泰锐生物技术有限责任公司合成。

1.1.6 探针与引物 根据GenBank 已公开发表的伯氏疏螺旋体16SrRNA 基因保守序列，设计TaqMan-MGB 探针及引物（表1），委托上海生物技术有限公司合成。

表1 荧光定量PCR 探针及引物

1.2 方法

1.2.1 标准菌株及蜱DNA 提取 伯氏疏螺旋体标准株B31、大肠杆菌标准株、沙门氏菌标准株以及钩端螺旋体标准株DNA 提取，均参照天根公司细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书进行：将蜱在75%酒精中浸泡15 min，用1×PBS 请洗3 次，然后置于干净的滤纸上吸水干燥；将干燥后的蜱3 只一组分组，每组加300 μL PBS 研磨至匀浆状，1 000g离心5 min，取上清，按照微量DNA 提取试剂盒说明书提取DNA。获得蜱DNA 样品共100份，-20 ℃保存备用。

1.2.2 16SrRNA 基因标准质粒构建 以伯氏疏螺旋体标准株B31 基因组DNA 为模板，进行PCR扩增。反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。将目的片段胶回收，然后连接PMD18-T 载体，转化大肠杆菌DH5 α，提取质粒测定浓度。

1.2.3 扩增体系及程序 PCR 反应体系按照试剂盒要求，冰上配制20 μL 反应体系，具体见表2。以提取的伯氏疏螺旋体标准株B31 基因组DNA 为阳性对照，反应程序设为95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40 个循环。

表2 PCR 反应体系

1.2.4 敏感性检测及标准曲线建立 分光光度仪测定伯氏疏螺旋体16SrRNA 基因标准质粒质量浓度为102 ng/μL，载体片段与16SrRNA 扩增片段长度共为4 214 bp。利用公式（1），计算16SrRNA基因标准质粒拷贝数。10 倍系列稀释伯氏疏螺旋体16SrRNA 基因重组质粒，分别以108、107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL 为 模板，进行real-time PCR 扩增，分析该方法的敏感性。以16SrRNA 基因重组质粒标准品108～101copies/μL进行荧光定量PCR 扩增，每个梯度设置3 个复孔，绘制标准曲线。

拷贝数（copies/L）=[6.02×1023×质粒质量浓度（ng/μL）×10-9]/[DNA 长度（bp）×660]（1）

1.2.5 特异性检测 分别以伯氏疏螺旋体标准株B31、大肠杆菌标准株、沙门氏菌标准株以及钩端螺旋体标准株的基因组DNA 为模板，进行real-time PCR 扩增，分析该方法的特异性。

1.2.6 蜱DNA 样品检测 将从伊犁、克拉玛依、阿拉山口3 个地区采集蜱提取的基因组DNA 100份为模板，利用建立的TaqMan-MGB 探针荧光定量PCR 方法检测伯氏疏螺旋体。

2 结果

2.1 敏感性测定及标准曲线建立

伯氏疏螺旋体16SrRNA 基因重组质粒拷贝数为2.2×1010copies/μL。将重组质粒稀释，取108～100copies/μL 为模板进行realtime PCR 扩增，可见该方法检测标准质粒灵敏度为102copies/μL（图1）。从建立的标准曲线（图2）可知，斜率为-3.533 4，截距为44.67，相关系数R2=0.993，表明该方法误差较小。

图1 标准质粒不同拷贝数荧光定量 PCR 扩增结果

图2 荧光定量PCR 重组质粒标准曲线

2.2 特异性检测

以伯氏疏螺旋体标准株B31、大肠杆菌标准株、沙门氏菌标准株以及钩端螺旋体标准株的基因组DNA 为模板，灭菌水为空白对照，进行real-time PCR 扩增，可见仅伯氏疏螺旋体标准株B31 出现扩增曲线（图3），Ct 为28.747，其余模板无扩增曲线，均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。

2.3 蜱样品检测

对新疆3 个地区采集的100 份蜱DNA 样本进行real-time PCR 检测，发现7 份样本出现阳性扩增，其余均为阴性。伯氏疏螺旋体标准株B31扩增良好，Ct 为28.440，而钩端螺旋体无扩增（图4）。

图3 荧光定量PCR 特异性检测结果

图4 荧光定量PCR 检测蜱DNA 结果

3 讨论

新疆是莱姆病疫源地[13]，人莱姆病平均感染率高达35.49%[14]。近年来，由于新疆畜牧业不断发展，动物养殖数量增大，养殖动物被蜱虫叮咬机会增多，患病动物数量不断增加且感染后并未引起重视，成为了莱姆病病原体的贮存宿主，造成该病的疫源地不断扩大，以及人群感染率上升[15]。目前针对莱姆病防治，缺乏有效的疫苗及治疗药物，因此控制媒介传播、加强检测是降低莱姆病暴发和流行的重要手段。

莱姆病实验室诊断中的聚合酶连反应（PCR）技术，因快速简便、敏感性高和特异性强等优点，近年来不断得到发展和应用。该技术弥补了伯氏疏螺旋体培养困难、耗时长以及血清学检测易造成假阴性或假阳性的缺点，已用于莱姆病病人受损皮肤组织、血液、关节液、脑脊液以及宿主动物血液、脏器和蜱伯氏疏螺旋体的检测[16]。传统PCR 技术对血液、血清以及血浆中伯氏疏螺旋体检测的灵敏度较低。而在PCR 定性基础上发展起来的荧光定量PCR 技术的检测灵敏性得到大大提高，且特异性和可靠性更强，可用于莱姆病疑似病人及动物的各组织DNA 及体液的检测[17-18]。荧光定量PCR 分为探针类和染料类。前者由于增加了探针识别步骤，特异性更高，后者则简便易行，成本较低。荧光标记探针可分为水解探针和杂交探针。目前应用较为广泛的是TaqMan 水解探针法。Fu等[19]通过建立TaqMan探针荧光定量 PCR方法，完成了对我国部分地区蜱以及血液样品中的伯氏疏螺旋体检测。TaqMan-MGB 探针与常规TaqMan探针不同在于，前者是在TaqMan 探针3'端增加小沟结合物（minor groove binder，MGB）水解探针。该修饰显著提高了探针与模板结合的TM 值，增加了探针的杂交稳定性，使结果更加精确[20]，并且探针3'端单一碱基错配，可抑制探针与模板的结合，因而提高了探针的特异性。

4 结论

本研究选取伯氏疏螺旋体16SrRNA 基因保守序列，设计特异性引物以及TaqMan-MGB 探针，并通过一系列优化建立了TaqMan-MGB 探针荧光定量PCR 方法。该方法具有较高的敏感性和特异性，可为今后新疆地区有效开展莱姆病检测及防控提供技术支撑。