姜黄素通过调控Tiam1蛋白表达影响鼻咽癌增殖与侵袭的研究

陈 娟1，贺秋冬1，艾小红2

(1.南华大学附属第二医院放疗科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第一医院放疗科，湖南 衡阳 421001 )

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是头颈部常见恶性肿瘤之一，其发病率高达20/105～50/105，人群分布上呈现显著种族差异性，好发于黄种人，而欧美发病率则较低。且以男性居多，男女发病率之比为2∶1～3∶1，40～60岁为发病高峰[1-3]。2018年中国新增鼻咽癌患者达60 000例左右，患者确诊时多为中晚期，且远处转移是临床上鼻咽癌治疗效果欠佳或死亡的主要原因[4]。因此，探究鼻咽癌增殖及侵袭相关标志物对鼻咽癌的早期诊断、治疗及预后具有重要的临床意义。近期研究证实：Tiam1(T-cell lymphoma invasion and metastasis-inducing factor1)高表达与胃癌细胞的侵袭和转移能力密切相关[5-6]，但Tiam1在鼻咽癌增殖及侵袭主要作用机制目前仍不清楚。姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗血管生成、抗肿瘤等多种功效。最近研究发现姜黄素可以通过诱导非编码长链RNA表达，增强鼻咽癌细胞对放射性治疗的敏感性，为鼻咽癌治疗中应用姜黄素提供了依据[7]。本课题通过免疫组织化学染色方法检测鼻咽癌组织中Tiam1的表达情况，分析鼻咽癌组织及鼻咽黏膜慢性炎症组织中Tiam1表达情况；以鼻咽癌5-8F细胞为实验对象，采用不同浓度的姜黄素处理鼻咽癌细胞，探讨姜黄素抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖及侵袭的机制。为姜黄素治疗鼻咽癌寻找新的作用靶点，为姜黄素作用于鼻咽癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

随机收集从2010年1月至2013年1月期间南华大学附属第一医院病理科保存的鼻咽癌石蜡标本共57例，鼻咽黏膜慢性炎症石蜡标本10例，并收集完整临床及病理资料，所有入选鼻咽癌病例活检前均未接受化疗或放疗(即初诊患者)，活检后均被病理确诊为鼻咽癌病例。细胞实验所用5-8F鼻咽癌细胞，由南华大学肿瘤研究所张志伟老师课题组馈赠。

1.2 免疫组化

南华大学附属第一医院病理科收集石蜡组织切片后，保存于4 ℃冰箱。实验脱蜡前，应将鼻咽癌组织及鼻咽慢性炎性组织切片置于在65 ℃温箱中烘烤30 min，吹风机吹3 min；然后进行脱蜡、水化、抗原修复、阻断、封闭、一抗孵育、复染、脱水、封片。姜黄素(上海丽臣商贸有限公司)；Tiam1抗体(美国Santa Cruz公司)、鼠抗人β-actin抗体(美国Abgent公司)孵育并洗涤后采用DAB显色，采用苏木精复染切片，用1%盐酸酒精分化、自来水冲洗、封片，最后送镜检。

1.3 结果判读采用双盲式阅片

组织封片待中性树胶干燥可永久保存后，用倒置光学显微镜观察，并进行拍照，每张切片先低倍镜(100倍)下初步观察，再于高倍镜下(400倍)随机选取5个视野，编号保存图片。实验结果判定标准[8]：Tiam1蛋白主要阳性表达于细胞浆，为浅黄至棕褐色颗粒，分布均匀，根据细胞的染色程度及阳性率进行判断。染色程度评分标准为：不着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞染色率评分标准为：阴性记为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。判断标准目前多采用积分法，公式如下：染色程度×阳性细胞率。标准参考0～2分为阴性，≥3者为阳性，每张切片至少随机选取5个视野，每视野随机选取100个细胞评价，取最后均值。

1.4 细胞的培养、复苏、传代及冻存

操作前准备：将已配好的新鲜培养基、PBS液、胰蛋白酶瓶放入37 ℃恒温水浴锅预热，备用。用75%酒精擦拭超净工作台台面，台面放置移液器、TIP头、酒精灯、打火机、污物盒紫外线照射30 min后，用75%酒精擦拭双手，正确摆放使用器械，点燃酒精灯。5-8F细胞复苏、细胞换液、传代、冻存，备用。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖活力

按细胞培养方法将对数生长期细胞制成2×104/mL单细胞悬液，实验设置溶剂对照组、空白对照组及5个浓度组，每组设置5个重复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养12 h后细胞基本贴壁，加入不同浓度的姜黄素(10～160 μmol/L)各100 μL，溶媒对照组加入0.1%DMSO100 μL，空白组加入100 μL培养基，培养24 h后倾去上清；用酶标仪测定波长为450 nm条件下的细胞的吸光度。

划痕实验:依照CCK-8实验结果，以姜黄素处理24 h后细胞活力值绘制生长曲线所得药物IC50为参考，选出3个实验浓度组，分别为20、60、100 μmol/L的姜黄素实验组；细胞培养方法将对数生长期细胞制成单细胞悬液，以106个细胞/孔接种于6孔板，以灭菌10 μL Tip头在6孔板中心划一条直线，24 h后观察划痕处细胞迁移情况并拍照。

侵袭实验:取Matrigel胶与1640培养基，按1∶4混合均匀(冰上操作)，铺胶(避免气泡)，置于37 ℃、5%CO2细胞培育箱中凝胶直至出现白色固态层；不同浓度姜黄素组及空白对照组分别加入对应细胞悬液200 μL/孔；置于37 ℃、5%CO2细胞培育箱中培养24 h，倒置显微镜下观察并随机选择3个视野进行细胞计数，拍照。

Western blot检测:提取不同浓度药物处理组及空白组细胞总蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳、转膜、PVDF膜的封闭、抗体的孵育、显色。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 Tiam1蛋白在鼻咽组织中表达

如图1、图2所示，通过免疫组化实验法检测57例不同病理类型的鼻咽癌组织及10例鼻咽黏膜慢性炎症组织中Tiam1表达情况。实验结果显示Tiam1在慢性鼻咽炎组织中低表达或不表达，在鼻咽癌中阳性表达率明显高于其在慢性鼻咽炎组织中表达率(P<0.05)。

图1 Tiam1蛋白在不同类型鼻咽组织的表达(SP，400×)A：鼻咽黏膜慢性炎症组织;B：鼻咽癌组织

图2 鼻咽组织中Tiam1阳性表达率与鼻咽黏膜慢性炎症组比较，*P<0.05

2.2 姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞增殖活力的影响

CCK-8实验结果显示，实验组细胞增殖被药物明显抑制，而未处理的鼻咽癌5-8F细胞体外生长情况良好，空白对照组与DMSO组增殖情况无差异(P>0.05)。图3显示24、48、72 h三个时间段，实验组5-8F细胞增殖随着姜黄素浓度改变而受到不同程度的抑制。相同姜黄素浓度处理下，因作用时间延长5-8F细胞增殖活力值下降；各组细胞处理时间一致的情况下，随着姜黄素浓度增加，细胞增殖抑制越显著。结果表明，姜黄素处理后细胞增殖能力降低，5-8F细胞增殖与姜黄素作用存在浓度和时间依赖性(P<0.05)。由于5-8F细胞周期约24 h，为排除细胞自然增殖对实验的影响，选取药物处理24 h的IC50值(56 μmol/L)作为调整实验组浓度的依据，设置三个药物处理组(20、60、100 μmol/L)和空白对照组继续Transwell及Western blot实验。

图3 姜黄素对5-8F细胞增殖活力的影响(24h、48h、72h)与对照组比较，*P<0.05

2.3 姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞迁移的影响

图4、图5所示为不同浓度姜黄素处理5-8F细胞24 h后细胞迁移变化，0 h时各组细胞划痕距离一致，处理24 h后，空白组划痕距离较实验组明显缩小，且随着姜黄素浓度增加，其迁移的距离越短(P<0.05)。

2.4 姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞侵袭能力的影响

图6、图7所示为不同浓度姜黄素处理5-8F细胞24 h后对细胞侵袭能力的影响，0 h时各组下层小室均未见穿膜细胞。处理24 h后，实验组穿膜细胞数较空白组明显减少，且随着姜黄素浓度增加，其穿膜细胞数越少(P<0.05)。

图4 0h和24h各组细胞迁移情况(10×)

图5 姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞迁移的影响与对照组比较，*P<0.05

2.5姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞Tiam1蛋白表达的影响

图8、图9所示为不同浓度姜黄素处理5-8F细胞24 h后细胞内Tiam1蛋白变化情况。空白组Tiam1蛋白表达含量明显高于实验组，实验组间：100 μmol/L组Tiam1蛋白表达量低于60 μmol/L、20 μmol/L组，20 μmol/L蛋白表达量最高，差异均有统计学意义。姜黄素能下调5-8F细胞中Tiam1蛋白表达，从而抑制5-8F细胞。

图6 不同浓度姜黄素对5-8F细胞侵袭能力影响(SP，200×)A:空白对照组;B:20 μmol/L组;C:60 μmol/L组;D:100 μmol/L组

图7 不同浓度姜黄素对5-8F细胞侵袭能力影响与对照组比较，*P<0.05

图8 姜黄素对5-8F细胞Tiam1蛋白表达的影响

图9 姜黄素对各组细胞Tiam1蛋白表达的影响与对照组比较，*P<0.05

3 讨 论

近年来，全球癌症发病率和死亡率逐年上升，据统计2015年我国将新增肿瘤患者约429.2万，因恶性肿瘤导致死亡病例约281.4万[1]。鼻咽癌是我国“两广”地区常见恶性肿瘤之一，EB病毒感染，环境因素和遗传易感性是鼻咽癌的主要病因。大部分鼻咽癌属于放疗敏感性恶性肿瘤，随着放化疗技术的不断发展，局限期鼻咽癌患者收获了较好的治疗效果，但伴有淋巴结转移的病例放化疗后复发转移率高，5年生存率仅为50%～60%[9]。目前鼻咽癌侵袭转移的分子机制尚不完全明确，深入了解与鼻咽癌侵袭转移相关的基因，对鼻咽癌的治疗及预后具有深远意义。

Tiam1是一个与肿瘤侵袭和转移相关的基因，可特异性激活Rho蛋白家族GTPase活性，其下游效应因子主要为Rho蛋白家族重要成员Rac1，参与Rac1介导的信号通路调控发挥相应生物学效应，如细胞骨架的活动，细胞内吞作用和膜转运，细胞迁移、粘附、侵袭、凋亡和肿瘤生成[10]。Tiam1在肝细胞癌[11]、食管癌[12]、直肠癌[13]、宫颈磷癌[14]均高表达，且与侵袭转移密切相关。本实验结果证实在鼻咽癌中，Tiam1蛋白高表达，实验结果显示Tiam1在鼻咽黏膜慢性炎症组织中低表达或不表达，Tiam1在鼻咽癌中表达明显高于鼻咽黏膜慢性炎症组织。接着本实验进一步证实中成药姜黄素姜抑制鼻咽癌增殖及侵袭可能与Tiam1蛋白表达降低相关。

姜黄素抗肿瘤作用主要是通过与多种生物效应蛋白作用，通过这些蛋白调控转录因子、生长因子、受体、细胞因子和酶，抑制细胞增殖、侵袭并促进凋亡。姜黄素与放化疗结合可增加治疗敏感性、减轻毒副反应、甚至可逆转肿瘤天然耐药性[7]。本实验运用姜黄素体外处理5-8F细胞，发现随着姜黄素浓度增加和作用时间延长，5-8F细胞增殖活力明显下降，增殖抑制呈浓度-时间依耐性，与Pan Y研究结果[15]相符合，说明姜黄素可以抑制鼻咽癌细胞的增殖活力。姜黄素是否能抑制鼻咽癌细胞的侵袭，本实验进行了划痕、Transwell实验，进一步证实姜黄素抑制鼻咽癌细胞侵袭能力。本研究证实一定浓度姜黄素处理5-8F细胞后其侵袭能力明显减弱。本实验结果与Wong TS[16]研究结果相似，说明姜黄素可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭。通过体外细胞模拟侵袭转移过程的实验结果，发现姜黄素对鼻咽癌细胞具有一定的抗侵袭作用，但是其具体通过何种分子机制作用仍需进一步探究可能存在的分子靶点。姜黄素处理后的5-8F细胞增殖及迁移能力均下降，其可能通过作用于多种蛋白发挥抗肿瘤效应，本实验运用免疫印迹法检测姜黄素处理后5-8F细胞Tiam1表达发现其表达明显下降，说明姜黄素可能通过抑制Tiam1表达而降低鼻咽癌细胞的增殖及侵袭。

本课题初步探讨鼻咽癌侵袭转移过程中的可能靶点及机制，通过免疫组化实验证实Tiam1在鼻咽癌组织中高表达，而姜黄素是一种具有潜在抗肿瘤转移的中草药，通过Western blot实验了解不同浓度姜黄素处理的鼻咽癌细胞Tiam1蛋白表达情况，结果显示随着姜黄素浓度增加，鼻咽癌5-8F细胞中Tiam1的表达量下降，细胞的迁移侵袭被抑制，进一步提示姜黄素可能通过抑制侵袭相关基因Tiam1的表达而抑制鼻咽癌的侵袭。以上实验结果初步揭示鼻咽癌的转移可能存在的靶点及姜黄素在鼻咽癌中的药理作用，为鼻咽癌的分期分级和治疗提供一定的理论依据。