大孔树脂纯化甜茶叶总黄酮及其纯化前后的抗氧化性

吴婕 吴学慧 徐高

摘要：通过对比聚酰胺、DM-130、LSA-40、DHP-600与FL-1等5种大孔树脂的静态“吸附-解吸”性能，筛选出最适合甜茶叶总黄酮分离纯化的大孔树脂，并对其动态纯化工艺条件进行探讨。结果表明，最适大孔树脂的动态“吸附-解吸”参数如下：上样液质量浓度为2.0 mg/mL，上样液体积为60 mL，上样液pH值为5.0，上样流速为 2 BV/h，洗脱剂乙醇体积分数为70%，洗脱剂用量为70 mL，洗脱流速为2 BV/h。在此优化条件下，得到甜茶叶总黄酮的纯度为39.6%。并且在抗氧化研究中，纯化后的甜茶叶总黄酮对2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基的抗氧化能力半抑制浓度（IC50值）由108.7 μg/mL降低到77.6 μg/mL。由结果可知，甜茶叶总黄酮经过FL-1大孔树脂的纯化，能够提高抗氧化能力，因此，它具有很好的医药保健品生产前景。

关键词：甜茶叶;总黄酮;FL-1大孔树脂;抗氧化性

中图分类号： R284  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0190-04

收稿日期：2018-09-12

基金项目：赤水河流域环境保护与山地农业发展协同创新中心开放基金（编号：遵师协同创新[2018]06）。

作者简介：吴 婕（1982—），女，贵州铜仁人，硕士，副教授，主要从事天然产物研究。Tel：（0856）5238982;

甜茶叶，别称伞花八仙叶，其味微甜，属于蔷薇科悬钩子属多年生多刺灌木，主要分布在广西、广东、湖南、贵州、江西等地[1]。甜茶叶既可入茶，亦可入药，被称为“神茶”。甜茶叶富含多种营养物质和微量元素，如生物类黄酮、氨基酸、锶、维生素B1、B2、B3、超氧化物歧化酶等。其中，黄酮类化合物可以降低血脂和胆固醇，也有抗炎和抗氧化作用[2-4]。因此分离纯化甜茶叶总黄酮，对于提高甜茶叶总黄酮的工业生产价值有重要意义。

在分离纯化植物活性成分的方法中，大孔树脂因具有成本低、无污染、操作简单、选择性好、可再生等优点而备受人们关注[5-7]，但是用大孔树脂分离纯化甜茶叶总黄酮的研究却鲜有报道。本研究以甜茶叶总黄酮的吸附量、吸附率与解吸率为考察指标，比较5种大孔树脂对总黄酮的“吸附-解吸”性能，筛选出最适宜分离纯化甜茶叶总黄酮的大孔树脂，并且通过大孔树脂的动态“吸附-解吸”试验，得到最适合大孔树脂分离纯化甜茶叶总黄酮的优化工艺参数。通过抗氧化性试验，表明优化条件下大孔树脂纯化甜茶叶总黄酮的抗氧化能力得到了较大提高。研究结果可为工业化生产甜茶叶总黄酮提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜茶叶，贵州健康茶科技有限公司;聚酰胺（60～100目），沧州宝恩吸附材料有限公司;DHP-600、FL-1型树脂，天津欧瑞生物科技有限公司;DM-130、LSA-40型树脂，郑州勤实科技有限公司;芸香苷标准品（分析纯），合肥博美生物有限公司;乙醇、氢氧化钠、盐酸等均为国产分析纯。

UV2300分光计，上海天美科学仪器有限公司;KL04A型离心机，湖南凯达公司;XT120A型电子天平，瑞士普利赛斯公司;FZ102微型植物粉碎机，上海书培实验设备有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;SHA-B恒温振荡仪，金坛市富华仪器有限公司。

1.2 黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al（NO3）3显色法测定黄酮含量。精确配制浓度为0.202 mg/mL的芸香苷标准品溶液，分别在25 mL容量瓶中加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL标准品溶液，加蒸馏水至总体积为6.0 mL;加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，摇匀静置10 min后，加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，摇匀静置10 min后，加入10.0 mL 4% NaOH溶液，用蒸馏水定容至刻度处，摇匀静置20 min。在波长510 nm处测定吸光度。以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制总黄酮质量浓度的标准曲线方程：y=6.749 9x-0.030 4（r2=0.999 7）。

1.3 大孔树脂吸附量、吸附率、解吸率及甜茶叶总黄酮纯度的计算

大孔树脂的吸附量、吸附率、解吸率及甜茶叶总黄酮纯度的计算公式如下：

H=（CⅠ-CⅡ）×VⅠ/MⅠ;（1）

P=（CⅠ-CⅡ）/CⅠ×100%;（2）

Q=CⅢ×VⅡ/[（CⅠ-CⅡ）×VⅠ]×100%;（3）

L=（CⅢ×VⅡ）/MⅡ×100%。（4）

式中：H为吸附量，mg/g;P为吸附率，%;Q为解吸率，%;L为纯度，%;CⅠ、CⅡ、CⅢ分别为初始、吸附平衡、解吸平衡的甜茶叶总黄酮的质量浓度，mg/mL;VⅠ、VⅡ分别为上样液甜茶叶总黄酮体积、解吸液乙醇体积，mL;MⅠ为大孔树脂的干质量，g;MⅡ为大孔树脂纯化后旋干物质的质量，g。

1.4 粗制甜茶葉总黄酮的方法

采用超声辅助浸提甜茶叶总黄酮技术，提取条件如下：超声波功率为120 W，提取时间为30 min，乙醇体积分数为75%，液料比为15 mL ∶1 g，提取温度为60 ℃，提取次数为2次，离心（1 800 r/min、15～20 min），取上清液，浓缩，旋干，得到粗制的甜茶叶总黄酮，备用。

1.5 大孔树脂的活化

用无水乙醇将大孔树脂浸泡24 h，再用蒸馏水洗去醇溶性杂质至无醇味，然后用4% HCl溶液浸泡4 h，再用蒸馏水冲洗酸溶性杂质至中性，然后用4% NaOH溶液浸泡4 h，最后用蒸馏水冲洗碱溶性杂质至中性，备用。

1.6 大孔树脂对甜茶叶总黄酮静态“吸附-解吸”性能的研究

在室温下，称取2.0 g大孔树脂于具塞三角瓶中，加入粗制的甜茶叶总黄酮溶液（浓度为0.93 mg/mL;体积为 80 mL），振荡24 h，测定吸附平衡后的甜茶叶总黄酮质量浓度。将吸附平衡后的大孔树脂先用蒸馏水冲洗至无色，再加入80 mL无水乙醇解吸液，振荡24 h，测定大孔树脂解吸后的甜茶叶总黄酮质量浓度。根据“1.3”节中的公式计算大孔树脂的吸附量、吸附率和解吸率，筛选出最合适纯化甜茶叶总黄酮的大孔树脂。

1.7 FL-1大孔树脂对甜茶叶总黄酮的动态“吸附-解吸”性能研究

大孔树脂在吸附过程中，除了本身的物理化学性质以外，上样液质量浓度、上样液pH值及上样流速都是影响大孔树脂纯化效果的重要因素。在室温下，用湿法将20 mL活化的FL-1大孔树脂装入层析柱（半径×高=10 mm×400 mm）中，考察甜茶叶总黄酮的上样液质量浓度（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）、上样液pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、上样流速（1、2、3 BV/h）与不同上样体积对FL-1大孔树脂吸附率的影响;此外，考察洗脱液乙醇的体积分数（50%、60%、70%、80%）及洗脱液体积对FL-1大孔树脂解吸率的影响。

1.7.1 上样液质量浓度对FL-1大孔树脂吸附率的影响 为了使加入的甜茶叶总黄酮的量相等，分别设pH值为5.0，上样液体积为80、40、26.7、20 mL，质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL，以2 BV/h的流速加入FL-1大孔树脂柱中。收集流出液并测定总黄酮的质量浓度，得出FL-1大孔树脂对不同质量浓度总黄酮的吸附率。

1.7.2 上样液pH值对FL-1大孔树脂吸附率的影响 取100 mL上样液，甜茶叶总黄酮质量浓度为2 mg/mL，pH值分别设为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以2 BV/h的流速加入FL-1大孔树脂柱中，收集流出液并测定总黄酮的质量浓度，考察甜茶叶总黄酮溶液pH值对大孔树脂吸附率的影响。

1.7.3 上样液流速对FL-1树脂吸附率的影响 取80 mL甜茶叶总黄酮上样液，质量浓度为2.0 mg/mL，pH值为5.0，分别以1、2、3 BV/h的流速加入FL-1大孔树脂柱中，按 5 mL/管收集流出液并测定总黄酮的质量浓度，直至流出液的质量浓度是原上样液质量浓度的1/10，绘制不同流速对应的FL-1大孔树脂柱动态吸附穿透曲线，找出泄漏点，得到最适宜的上样流速和上样体积。

1.7.4 洗脱剂体积分数对FL-1大孔树脂解吸性能的影响  向吸附饱和的FL-1大孔树脂柱中，以3 BV/h的洗脱流速，加入60 mL体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮的质量浓度，得到不同体积分数洗脱剂的解吸率。

1.7.5 洗脱流速和洗脱剂体积对FL-1大孔树脂解吸性能的影响 向吸附甜茶叶总黄酮的饱和FL-1大孔树脂柱中，加入体积分数为70%的乙醇溶液，分别以1、2、3 BV/h的流速进行洗脱。按10 mL/管收集洗脱液，测定洗脱液的总黄酮质量浓度，计算FL-1大孔树脂柱在不同洗脱速度下的动態解吸率，确定最佳洗脱流速和洗脱液用量。

1.8 FL-1大孔树脂纯化工艺的验证

得到粗制的甜茶叶总黄酮溶液（pH值为5.0，浓度为 2.0 mg/mL，体积为60 mL）后，设上样流速为2 BV/h，加入 20 mL FL-1大孔树脂层析柱（半径×高=10 mm×400 mm）中，进行动态吸附，收集流出液，计算吸附率。当FL-1大孔树脂柱吸附平衡后，按照2 BV/h的洗脱速度，加入70 mL体积分数为70%的乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，计算解吸率。进行3次平行试验，取均值，验证FL-1大孔树脂纯化甜茶叶总黄酮的可行性及稳定性。

1.9 粗制和纯化的甜茶叶总黄酮对2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基的抗氧化性

将粗制和纯化的甜茶叶总黄酮配制成不同质量浓度的待测液，同时以维生素C作为参比。参考林恋竹等的方法[7]，测定它们对ABTS自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的静态“吸附-解吸”试验

大孔树脂的空间结构、极性和粒径决定其对活性成分的“吸附-解吸”性能。由表1可以看出，在相同条件下，5种大孔树脂对甜茶叶总黄酮都有一定的“吸附-解吸”能力，其静态吸附能力排序为FL-1>聚酰胺（60～100目）>HPD-600>LSA-40>DM-130;其静态解吸能力排序为HPD-600>FL-1>LSA-40>DM-130>聚酰胺（60～100目）。综合考虑吸附率和解吸率，FL-1大孔树脂是纯化甜茶叶总黄酮较为理想的树脂。

2.2 FL-1大孔树脂的动态“吸附-解吸”性能研究

2.2.1 上样液质量浓度对FL-1大孔树脂吸附率的影响 由图1可知，当上样液浓度为1.0 mg/mL时，FL-1大孔树脂的吸附率达到最大值93%。当上样液的质量浓度为1.0～2.0 mg/mL 时，FL-1大孔树脂的吸附率随着上样液质量浓度的增加而缓慢降低，若继续增加上样液质量浓度，其吸附率迅速降低。这是由于在等温条件下，当上样液质量浓度较低时，黄酮类化合物与树脂接触得越充分，大孔树脂的吸附率越高，但是吸附量较小;当上样液质量浓度过大时，受到大孔树脂吸附容量和孔容的影响，导致大孔树脂吸附量、吸附率均减小。考虑到上样液质量浓度过低会导致吸附量太小，纯化效率不高，而上样液质量浓度过高会导致大孔树脂吸附不充分，浪费原料。因此，甜茶叶总黄酮的上样液质量浓度选择 2.0 mg/mL 为共宜。

2.2.2 上样液pH值对FL-1大孔树脂吸附率的影响 如图2所示，FL-1大孔树脂对甜茶叶总黄酮的吸附率随着上样溶液pH值的增加呈现先升高后降低的趋势。当pH值为5.0时，甜茶叶总黄酮的吸附率达到最大值89%，这是因为当上样溶液pH值为5.0时，溶液中的黄酮类化合物主要以分子形式存在，有利于FL-1大孔树脂的吸附。若上样溶液pH值较小，黄酮分子易形成“徉盐”;若上样溶液pH值较大，黄酮类化合物以离子状态存在，都不利于FL-1大孔树脂对甜茶叶总黄酮发生物理吸附作用。因此，甜茶叶总黄酮上样液的pH值为5.0时较适宜。

2.2.3 上样液流速和上样体积的确定 由图3可知，甜茶叶总黄酮的上样流速越快，渗漏点也出现得越早。当上样流速为1 BV/h时，上样体积约为80 mL时出现泄露点;当上样流速为2 BV/h时，上样体积约为60 mL时出现泄漏点;当上样流速为3 BV/h时，上样体积约为30 mL时就出现了泄漏点。因为大孔树脂的吸附过程主要是活性成分在大孔树脂的膜扩散和粒扩散的过程[8]，上样流速越快，甜茶叶黄酮类化合物与大孔树脂接触的时间越短，它们还没有来得及被吸附到树脂表面或孔内就流出树脂柱。所以，在上样液质量浓度相同的情况下，当上样流速为3 BV/h时，FL-1大孔树脂柱对甜茶叶总黄酮的吸附量小，吸附率较低;当上样流速为1 BV/h时，FL-1大孔树脂柱对甜茶叶总黄酮的吸附量和吸附率相对较高。然而，在实际工业生产中，上样流速过慢会导致生产效率低，因此选择上样流速为2 BV/h较好，并且在此条件下的最佳上樣体积为60 mL。

2.2.4 不同体积分数的洗脱剂对FL-1大孔树脂洗脱效果的影响 由图4可知，随着洗脱液乙醇体积分数的增加，甜茶叶总黄酮的洗脱率先提高后略有降低。当乙醇体积分数为50%～70%时，乙醇体积分数越大，它对甜茶叶黄酮类化合物的解吸率也越高;当乙醇体积分数为70%时，甜茶叶总黄酮的解吸率为83%;当乙醇体积分数为80%时，甜茶叶总黄酮的解吸率为85%。但是与体积分数为70%的乙醇得到的洗脱率相比，体积分数为80%的乙醇得到的解吸率提高得较慢。这是因为乙醇体积分数越大，洗脱剂的极性越弱，较小极性的黄酮类化合物更加容易被洗脱[9];但是当乙醇体积分数过大时，醇溶性杂质会增多，它们会与甜茶叶黄酮类化合物形成竞争，使甜茶叶黄酮类化合物与乙醇-水分子结合的可能性下降，导致甜茶叶总黄酮解吸率降低。综合考虑，乙醇溶液的体积分数以70%为宜。

2.2.5 洗脱剂流速及洗脱体积的确定 由图5可知，随着洗脱液流速的增加，洗脱出的甜茶叶总黄酮的质量浓度形成的峰形越宽，并且拖尾现象越明显，洗脱体积也越大;但是洗脱流速太小会导致洗脱时间过长，工业生产效率低。综合考虑，最佳洗脱流速为2 BV/h，最佳洗脱体积用量为70 mL。

2.3 FL-1大孔树脂纯化工艺的验证

由表2可知，FL-1大孔树脂对甜茶叶总黄酮的吸附、解吸和纯化的性能较好，其吸附量、解吸率、解吸后的纯度分别为41.7 mg/g、81.5%、39.6%。因此可见，在工业生产中 FL-1大孔树脂纯化甜茶叶总黄酮具有操作上的可行性。

2.4 纯化前后的甜茶叶总黄酮对ABTS自由基清除能力的比较

ABTS·是由强氧化剂与ABTS盐反应制备的，其氧化还原电势较低，可以通过电子传递（ET）反应机制或者通过氢原子转移（HAT）机制使自由基失去活性，从而导致体系绿色减退[9]。由图6可以看出，纯化前后的甜茶叶总黄酮对ABTS自由基均具有一定的清除能力，并且清除率与总黄酮的质量浓度有较强的正相关性（r2=0.97）;当甜茶叶总黄酮质量浓度相同时，纯化后的总黄酮清除能力更接近维生素C，纯化后的总黄酮对ABTS自由基清除的半抑制浓度（IC50值）由1087 μg/mL降至77.6 μg/mL。由此可见，FL-1纯化的甜茶叶总黄酮具有较强的抗氧化能力。

3 结论

通过静态“吸附-解吸”试验，筛选出最适用于甜茶叶总黄酮分离纯化的FL-1大孔树脂。在动态“吸附-解吸”试验中，得到FL-1大孔树脂优化甜茶叶总黄酮的纯化工艺参数：上样液质量浓度为2.0 mg/mL，上样液体积为60 mL，上样液pH值为5，上样流速为2 BV/h;洗脱剂乙醇体积分数为70%，洗脱剂用量为70 mL，洗脱流速为2 BV/h。在此条件下，得到甜茶叶总黄酮的纯度为39.6%。在抗氧化性研究中，当甜茶叶总黄酮质量浓度相同时，纯化后的总黄酮对ABTS自由基清除的IC50由108.7 μg/mL降至77.6 μg/mL，用FL-1纯化的甜茶叶总黄酮具有较强的抗氧化能力。综合分析可知，FL-1大孔树脂分离纯化甜茶叶总黄酮的纯化效率高，纯化后的总黄酮更具有商业价值。

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