QuEChERS-液质联用法同时测定农产品中3种农药及其代谢物残留

孙明娜 余璐 王雯雯 王梅 董旭 童舟 褚玥 杨通 高同春 段劲生

摘要[目的]建立同时检测农产品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈及其代谢物残留的QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法。[方法]样品用乙腈提取，经C 18净化，采用UPLC-MS/MS检测，基质匹配外标法进行定量。[结果]在5种基质（糙米、面粉、玉米、白菜、苹果）中，农药及代谢物在0.005～0.500 mg/L线性关系良好，相关系数大于0.996，定量限均小于10 μg/kg。在0.01、 0.10和1.00 mg/kg添加水平下，平均回收率为71.2%～105.0%，相对标准偏差（RSD）为1.28%～16.70%。[结论]该方法灵敏度、准确度和精密度均满足农药残留分析的要求，可用于农产品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈及其代谢物残留的同时检测。

关键词QuEChERS;UPLC-MS/MS;农药残留;农产品;代谢物

中图分类号TQ 450.2文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0211-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.059

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Determination of Three Pesticides and Their Metabolite Residues in Agricultural Products by-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Ming-na1，YU Lu1，WANG Wen-wen2 et al（1.Institute of Plant Protection and Agricultural Product Quality Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Agricultural Product Quality and Safety Risk Assessment Laboratory of Ministry of Agriculture and Rural Agriculture （Hefei），Hefei，Anhui 230031;2.Anhui Jianghuai Horticultural Seed Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230000）

Abstract[Objective]The research aimed to establish a method of simultaneous detection of phorate，prothioconazole and fipronil and its metabolite residues in agricultural products by QuEChERS-UPLC-MS/MS.[Method]The samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up by C 18，determined by UPLC-MS/MS and quantified by the matrix-matched external standard method.[Result]The calibration curves were linear in the range of 0.005-0.500 mg/L with the correlation coefficients larger than 0.996，the limits of quantitation were less than 10 μg/kg in five different matrix （brown rice，wheat flour，maize，Chinese cabbage，apple）.The mean recovery of 9 pesticides were 71.2%-105.0% and the relative standard deviation （RSD） was 1.28%-16.70% at 0.01，0.10 and 1.00 mg/kg with hree spiked levels.[Conclusion]The sensitivity，accuracy and precision of the method meet the requirements of pesticide residue analysis，and can be used for simultaneous detection of phorate，prothioconazole and fipronil and their metabolite residues in agricultural products.

Key wordsQuEChERS; UPLC-MS/MS; Pesticide residues;Agricultural products;Metabolites

甲拌磷是高毒廣谱内吸性杀虫剂，主要用于防治地下害虫、蚜虫等。甲拌磷在自然条件下经过氧化反应产生毒性更大的2种代谢物甲拌磷砜和甲拌磷亚砜。甲拌磷砜和甲拌磷亚砜在环境中比较稳定，其残留期比甲拌磷长[1]。丙硫菌唑是新型广谱三唑硫酮类杀菌剂，广泛应用于谷类、麦类、豆类农产品中，对麦类病害有很好的防效，其在作物中的主要代谢物是其脱硫产物硫酮菌唑[2]。氟虫腈是苯基吡唑类杀虫剂，可用于防除鳞翅目和直翅目害虫以及地下鞘翅目害虫的幼虫。在氟虫腈施用于作物的过程中，主要代谢产物有氟虫腈硫醚（MB 45950）、氟虫腈砜（MB 46136）、氟甲腈 （MB 46513），都有一定毒性，有的甚至高于母体[3]。国家标准GB 2763—2016《食品安全国家标准 食品中最大农药残留限量》中规定了甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈在食品中的最大残留限量，并且残留量均包括农药母体和其代谢物之和。然而，标准中推荐的检测方法并不完全覆盖农药母体及其代谢物，如检测甲拌磷的标准方法GB/T5009.20—2003只检测甲拌磷，不检测甲拌磷砜和甲拌磷亚砜;检测氟虫腈的标准方法SN/T 1982—2007和NY/T 1379—2007都仅仅检测氟虫腈不包括其代谢物。丙硫菌唑暂无国标检测方法。由于甲拌磷、丙硫菌唑、氟虫腈及代谢物残留能同时检测的方法缺失，造成农产品中检测方法标准和残留判定标准的不一致。另一方面，上述3种农药及其代谢物需要在不同方法的不同仪器中检测，方法繁琐，检测效率低。因此，建立快速准确的农产品中甲拌磷、丙硫菌唑、氟虫腈及其代谢物的测定方法尤为重要。

目前国内外有关检测甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈的主要方法有液相色谱法[4-5]、气相色谱法[6-8]、气相色谱质谱法[9-10]、气相色谱串联质谱法[11]、液相色谱串联质谱法[12-15]。甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈残留量检测方法的研究虽然报道较多，但多以水果、蔬菜中的测定方法为主。目前有关农产品中同时检测甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈及其代谢物的快速测定方法鲜见报道。QuEChERS 是一种快速、简单、高效、廉价的样品前处理方法，已广泛应用于水果、蔬菜、谷物等低脂肪类基质中农药残留的测定[16-18]。笔者建立基于QuEChERS方法的超高效液相色谱-串联质谱同时测定农产品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈及其代谢物残留量的方法，以期为农产品中农药残留的检测工作提供技术支撑。

1材料与方法

1.1供试药剂3种农药及其代谢物（以下简称9种化合物）标准品均购于美国Achemtek公司;C 18吸附剂购于天津博纳艾杰尔科技有限公司;氯化钠为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司;甲醇、乙腈为色谱纯，购于美国TEDIA公司;乙酸铵、甲酸为色谱纯，购于美国aladdin公司。

1.2仪器ACQUITY 超高效液相色谱-Xevo TQ-S 三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）;涡旋混合器（德国IKA公司）;ZB-85气浴恒温振荡器（江苏金坛市中大仪器厂）;HC-3018高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

1.3前处理方法

称取5.0 g匀浆样品于50 mL具塞离心管中，加入5 mL水、10 mL乙腈，振荡1 h，再加入3 g 氯化钠，涡旋1 min，以4 500 r/min离心5 min。取2 mL上层提取液于含有50 mg C 18和150 mg无水硫酸镁的10 mL离心管中，涡旋1 min，以7 000 r/min离心5 min，取上清液过  0.22 μm 微孔膜过滤供UPLC-MS/MS分析。

1.4仪器条件

1.4.1液相色谱条件。色谱柱为 Waters CORTECS UPLC C 18（粒径1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流动相A为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液;B为甲醇;流速0.25 mL/min;进样体积5 μL;柱温40 ℃;洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序如下：0～ 1 min，5% B相～40% B相;1～3 min，40% B ～80% B相;3～ 5 min，80% B相～5% B相;5～6 min，5% B相。

1.4.2质谱条件。毛细管电压为0.5 kV;离子源温度 150 ℃;去溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，去溶剂气流速为 1 000 L/h;锥孔电压4 V;碰撞气为高纯氩气。3种农药及其代谢物的质谱参数见表1。

1.5标准储备溶液的配制

1.5.1农药单标溶液的配制。准确称取各农药标准品10 mg（精确至0.01 mg）分别置于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，分别配成1 000 mg/L的标准母液，于4 ℃避光保存。

1.5.2混合标准溶液的配制。根据单标浓度，准确量取适量单标溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，于4 ℃避光保存。

1.6标准曲线的绘制分别用乙腈、糙米空白基质溶液、面粉空白基质溶液、玉米空白基质溶液、白菜空白基质溶液和苹果空白基质溶液稀释，配制成0.001、0.005、0.010、0.050、 0.100和0.500 mg/L系列标准溶液，按“1.4”条件测定。以溶液质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制工作曲线，外标法定量。

1.7添加回收试验

分別在空白样品中添加适量的混合标准溶液，添加水平为0.01、0.10和1.00 mg/kg，每个水平重复5次。按“1.3”和“1.4”的步骤进行样品前处理和分析测定，并设空白对照。计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

1.8基质效应评估方法基质效应（ME）按以下公式进行计算：

ME=（基质匹配标准曲线斜率纯溶剂标准曲线斜率-1）×100%

|ME|<20%为弱基质效应，可忽略而无需采取补偿措施;20%≤|ME|≤50%为中等程度基质效应， |ME|>50%为强基质效应，须采取措施补偿基质效应。

2结果与分析

2.1色谱条件的优化

比较甲醇-水、乙腈-水及在水相中添加不同体积分数的调节剂甲酸（0.02%、0.05%和0.1%）、乙酸铵（2、 5和10 mmol/L）对9种化合物的分离度、灵敏度和峰型的影响，结果表明，在流动相中加入微量的甲酸和乙酸铵均可改善峰型，有效提高目标化合物的响应值。目标化合物的响应值随着甲酸的浓度增大而增大。而当乙酸铵的浓度由5 mmol/L提高至10 mmol/L时，其响应值并未明显增加。将有机相甲醇换成乙腈后，发现目标峰的响应值降低。因此，经优化后最终采用5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相。

2.2质谱条件的优化

以5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相，在正负离子模式下，对9种化合物的标准溶液（0.1 mg/L）分别进行全扫描，结果发现， 9种目标化合物均获得稳定的母离子。然后进行子离子扫描，优化碰撞能，每种化合物选择离子丰度最高、基质干扰最小的2个离子对作为特征离子对，其中信号较大的离子对作为定量离子对。在最佳条件下，9种目标化合物能够进行定性与定量检测，如图1所示。

2.3分散吸附剂的选择

以回收率及净化效果为指标，考察50 mg PSA（N-丙基乙二胺）、50 mg C 18、50 mg GCB（石墨化炭）3种分散吸附剂的净化效果。在添加0.1 mg/kg的目标化合物水平下，按照“1.3”方法进行提取，提取液分别用以上3种分散吸附剂进行净化，以糙米为例，测得的回收率见图2。结果表明，采用PSA净化时，净化效果较差，基质效应最大，导致甲拌磷亚砜、硫酮菌唑、氟虫腈硫醚等农药的回收率均高于120%，相对标准偏差较大;采用GCB净化时，GCB对丙硫菌唑和硫酮菌唑几乎完全吸附;而采用C 18净化时，9种化合物的回收率结果最优（94.6%～111.0%），相对标准偏差为1.9%～5.9%，基质效应较小，符合检测方法的要求。进一步优化C 18吸附剂的用量，发现C 18用量为50 mg时，目标化合物的回收率最高。综合考虑，最终选择50 mg C 18作为净化吸附剂。

2.4方法学验证

2.4.1线性范围、检出限、定量限和基质效应。

按照“1.6”方法对空白样品进行处理，然后配制0.005～0.500 mg/L系列空白基质匹配标准溶液和纯溶剂标准溶液，其在糙米、面粉、玉米、白菜和苹果这5种样品基质中检测的结果列于表2。由表2可知，9种化合物在5种基质中均表现基质抑制效应，其中大部分为中等和强的基质抑制效应，所以该试验采用基质匹配标准溶液的方法，来降低基质效应的影响。5种基质中9种化合物在0.005～0.500 mg/L均呈良好的线性关系，相关系数（r）为0.995 9～0.999 9，检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别为0.01～3.46和0.04～8.99 μg/kg。

2.4.2准确度和精密度。

从表3可看出，在0.01、0.10和 1.00 mg/kg 3个添加水平下，糙米、面粉、玉米、白菜和苹果基质中9种化合物的平均回收率分别为74.4%～95.1%、73.4%～102.0%、80.2%～105.0%、73.4%～102.0%和71.2%～ 102.0%，相对标准偏差分别为3.86%～16.70%、1.98%～ 11.70%、 2.30%～8.95%、2.76%～8.04%和1.28%～15.60%。表明该方法有较好的准确性和稳定性，满足农药残留分析的 要求。

3结论与讨论

建立同时检测甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈及其代谢物的多残留检测方法，首先是色谱检测条件的优化。在三重四级杆串联液质仪条件下，获得稳定的分析条件需要对流动相配比进行优化。微量的甲酸（0.1%）和乙酸铵（5 mmol/L）均可明显改善峰型，并且响应值随着甲酸的浓度增大而增大。有机相中选择甲醇比乙腈的响应值更高。因此，经优化后最终采用5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相。

9种化合物在5种基质中均表现基质抑制效应，其中大部分为中等和强的基质抑制效应，所以该试验采用基质匹配标准溶液的方法，来降低基质效应的影响。样品基质中存在不同的杂质，用吸附剂进行分散固相萃取，是常用的净化方法。PSA（N-丙基乙二胺）主要是去除糖类和有机酸等，GCB（石墨化炭）主要用于去除色素，C 18主要用于去除脂类干扰，通过净化效果比较，选择C 18作为吸附剂，可以取得良好的净化效果和满意的回收率（94.6%～111.0%）。

该研究建立了QuEChERS方法净化，超高效液相色谱串联质谱检测农产品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟虫腈及其代谢物残留的检测方法。该方法简单、快速、准确、灵敏度高，满足痕量分析要求，适用于糙米、面粉、玉米、白菜和苹果等农产品中农药残留的检测。

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