西兰花茎叶蛋白酶解工艺优化

李漫 魏好程 何传波 马英 熊何健

摘要[目的]采用响应面法优化西兰花茎叶蛋白酶解工艺条件。[方法]以西兰花茎叶蛋白为原料，选取pH、温度、加酶量和底物浓度为自变量，水解度为响应值，在单因素试验基础上，运用 Box-Behnken 中心组合试验设计和响应面（RSM），确定最佳酶解工艺参数。[结果]碱性蛋白酶水解西兰花茎叶蛋白最佳的酶解条件是pH10、温度55 ℃、加酶量2 800 U/g、底物浓度4%。[结论]碱性蛋白酶对西兰花茎叶蛋白酶解工艺优化合理、可行，该研究为西兰花茎叶蛋白的综合利用提供了参考。

关键词西兰花;茎叶蛋白;酶解;响应面优化

中图分类号TS 225.1文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.047

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Proteolysis Technology of Broccoli Stem and Leaf

LI Man，WEI Hao-cheng，HE Chuan-bo et al（School of Food and Bioengineering，Jimei University，Xiamen，Fujian 361021）

Abstract[Objective]The response surface methodology was used to optimize the proteolytic conditions of broccoli stems and leaves.[Method]With broccoli stem and leaf protein as raw material，pH，temperature，enzyme amount and substrate concentration were selected as independent variables，and hydrolysis degree was used as response value.Based on single factor experiment，Box-Behnken center combined test design and response were used to determine the optimal enzymatic process parameters.[Result]Alkaline protease hydrolysis of broccoli stem and leaf protein optimal enzymatic conditions were pH10，temperature 55 ℃，enzyme amount 2 800 U/g，the concentration of substrate 4%.[Conclusion]Alkaline protease is reasonable and feasible for the proteolysis process of broccoli stem and leaf.The study provides a reference for the comprehensive utilization of broccoli stem and leaf protein.

Key wordsBroccoli;Stem and leaf protein;Enzymatic hydrolysis;Response surface optimization

西兰花（Brassica oleracea）俗称绿菜花，为十字花科芸薹属二年生植物[1]。西兰花营养成分丰富，被称为“蔬菜王冠”，具有非常高的食用和药用保健价值[2]。我国是西兰花种植大国，2014年我国西兰花产量约占全球总量的38%[3]。西兰花种植、加工过程中，会产生大量的茎、叶副产物，除少量作为饲料利用外，大部分被废弃，既导致资源浪费，又产生环境污染，对西兰花产业的健康发展产生不良影响，西兰花残次果和茎叶副产物的资源利用问题亟待解决。

西蘭花茎叶中含有膳食纤维、蛋白质、类黄酮和萝卜硫素等多种营养成分和生理活性物质，是一种非常有价值的副产物资源。Campas-Baypoli等[4]研究表明，西兰花茎干粉中蛋白质含量高达22.41%。Xu等[5]利用西兰花茎叶蛋白，酶解获得了具有强ACE抑制活性的二肽Val-Trp，IC 50值为 31.30 μmol/L。党亚丽等[6]通过酶解西兰花茎叶蛋白，获得分子量为310～2 600 Da的西兰花蛋白肽，该肽组分能显著提高小鼠淋巴细胞转化能力（P<0.05） 和小鼠碳粒廓清功能（P<0.05），具有增强免疫活性。笔者以西兰花茎叶蛋白为原料，以水解度为指标，研究了碱性蛋白酶对西兰花茎叶蛋白的水解效果，通过单因素试验和响应面分析优化酶解条件，旨在为酶技术应用于西兰花茎叶蛋白酶解生物活性肽的功能性研究提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

西兰花茎叶蛋白浆（蛋白质占干物质含量46.34%）来自台州市天莱生物科技有限公司，经冻干后 -20 ℃保存备用;碱性蛋白酶（酶活力1.01×105 U/g） 购自诺维信（中国）生物技术有限公司;三氟乙酸购自Sigma公司;甲醛 AR等其余试剂为国药分析纯。

1.2仪器与设备

FA1004 型电子天平（上海精科天平）;UV8000A型紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器公司）; LEAD-2 pH 计（上海奥豪斯仪器有限公司）;JDC-0.2真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）;电热式恒温水浴锅（天津欧诺仪器仪表有限公司）;ULTMATE3000高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）。

1.3方法

1.3.1西兰花茎叶蛋白酶解流程。

西兰花茎叶蛋白浆→冷冻干燥→配制西兰花茎叶蛋白悬浮液→85 ℃灭菌20 min→调pH、加酶→恒温水浴锅酶解→100 ℃灭酶15 min→200 nm孔径陶瓷滤膜，取透过液→200 Da孔径卷式膜，取截留液→西兰花茎叶蛋白酶解液。

1.3.2分析测定方法。蛋白含量采用微量凱氏定氮法测定;水解度采用甲醛电位滴定法测定[7]，通过式（1）计算水解度。

水解度=C×（V1-V0）×0.014×m/（5×M）×100%  （1）

式中，C为NaOH浓度（mol/L）;V1为样品在加入甲醛后消耗NaOH标准溶液体积（mL）;V0为空白在加入甲醛后消耗NaOH标准溶液体积（mL）;m为酶解液氨基氮质量（mg）;M为样品总氮质量（mg）。

1.3.3单因素试验。

以水解度为指标，固定酶解时间为3 h，选择底物浓度和加酶量进行单因素试验。其他基础条件参照酶的说明书和向厂家询问的最适条件。各个因素变化梯度分别为底物浓度（2%、3%、4%、5%、6%）、加酶量（1 000、 2 000、3 000、4 000和5 000 U/g）。

1.3.4西兰花茎叶蛋白酶解条件优化。

选取pH、酶解温度、底物浓度和加酶量4个因素，以水解度为响应值，运用4因素3水平的Box-Behnken中心组合试验，优化碱性蛋白酶酶解参数，其响应面因素及水平如表1所示。

1.3.5西兰花茎叶蛋白酶解物中蛋白肽的分子量分布。色谱条件：凝胶柱TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm）;流动相为乙腈/超纯水/TFA=45/55/0.1（V/V），流速为 0.5 mL/min;检测波长为220 nm;柱温30 ℃。选用GSH（还原型谷胱甘肽，MW 307.00 Da）、GSSG（氧化型谷胱甘肽，MW 613.00 Da）、杆菌肽（MW 1 422.69 Da）、胰岛素（MW  5 777.54 Da）和细胞色素C（MW 12 384.00 Da）为标准品，通过凝胶色谱测定酶解产物蛋白肽分子量分布。

1.4数据统计分析

试验结果由Microsoft Excel 2007进行处理，采用SPSS 19.0软件对各组数据进行单因素方差分析，Duncans法进行多重比较。

2结果与分析

2.1西兰花茎叶蛋白酶解单因素试验结果

2.1.1加酶量。由图1可知，随着酶添加量的增大，水解度呈上升趋势，但过了2 000 U/g曲线斜率变小，这是由于在酶解反应初期，加酶量的增大可以使更多的底物被作用，从而提高水解速度;当加酶量达到一定程度时，酶量的增加反而会抑制酶解速度[8]。周雪松[9]的研究表明，当酶用量大于最适浓度时，过量的酶很难与底物接触，其对底物蛋白的水解能力不会明显提高，如果酶量过大甚至会引起酶的自溶增强。考虑到试验成本和试剂最大利用率，加酶量选 2 000 U/g左右较合适。

2.1.2底物浓度。由图2可知，在酶解过程中，底物浓度为2%～4%时，随着底物浓度的增加，水解度有明显的提升，但是当底物浓度进一步增大时，水解度虽然也增大，但是提升的趋势平缓。这是因为底物浓度的增大，降低了体系中的酶浓度，使得酶促反应速度下降，水解度降低[10-11]，故选择底物浓度3%左右较为合适。

2.2西兰花茎叶蛋白碱性蛋白酶水解条件优化

在单因素试验基础上，固定碱性蛋白酶酶解时间为3 h，选取pH、酶解温度、底物浓度和加酶量4个因素，以水解度为响应值，运用响应面试验设计，优化碱性蛋白酶酶解参数，试验结果见表2。

对表2结果进行多元拟合分析，得到碱性蛋白酶水解度对pH、温度、加酶量和底物浓度的二次多项回归方程Y= 19.47+2.38A+1.02B+4.44C+2.62D+2.74AB+0.75AC- 0.060AD+1.35BC+0.34BD+1.70CD-1.10A2-1.71B2-0.85C2- 2.92D2，R2=0.990 2。由回归模型方差分析可知，二次多项回归方程P<0.000 1，表明该二次多项回归模型高度显著，且失拟值为0.534 3>0.05，不显著，表明模型与实际情况拟合得很好，预测值与实际测量值之间具有高度的相关性，可以应用到理论的预测[12]。由F值可以看出，影响碱性蛋白酶酶解效果的各因素主次关系为底物浓度（C）>加酶量（D）>pH（A）>温度（B）。通过数据分析，确定碱性蛋白酶最优酶解条件为pH10、酶解温度55 ℃、加酶量2 800 U/g、底物浓度4%，此条件下碱性蛋白酶实际水解度为31.13%，与理论水解度 30.29%基本一致。

2.3西兰花茎叶蛋白酶解影响因素交互作用分析

对两因素间交互作用的交互分析采用降维分析法。观察响应面的陡峭程度可看出因素变化对响应值的影响效果，响应面越平缓，说明响应值对因素变化不敏感，反之，则表示响应值对因素变化比较敏感，简而言之，随着因素的变化响应值会做出相应的敏感反应[13]。该研究根据回归方程建立响应面图（图3）。观察图3中各个响应面可知， AB、BC、CD存在极显著的交互作用（P<0.01）;AC之间的交互作用显著（ 0.010.05）。

2.4西兰花茎叶蛋白酶解物中蛋白肽分子量分布

西兰花茎叶蛋白酶解物中主要成分为小分子蛋白肽。标准品对应的洗脱时间分别为细胞色素C为11.90 min，胰岛素为 14.13 min，杆菌肽为15.86 min，GSSG为19.01 min，GSH为19.85 min。相同条件下测定西兰花茎叶蛋白肽的分子质量，其分子质量的分布如图4所示，西兰花茎叶蛋白主要水解为相对分子量3 000 Da以下的小分子肽，其中分子量1 000 Da以下组分占65.63%。

3结论

该研究以西兰花茎叶蛋白为原料，水解度为响应值，通过单因素试验和响应面设计分析优化碱性蛋白酶酶解西兰花茎叶蛋白的工艺条件。最终确定碱性蛋白酶酶解西兰花茎叶蛋白的最佳酶解条件为pH 10、温度55 ℃、加酶量 2 800 U/g、底物浓度4%，此条件下碱性蛋白酶实际水解度为31.13%，与理论水解度30.29%基本一致。

以往的研究发现，活性肽所具有的抗氧化以及抗菌等活性跟其分子量大小有着密切關联，一般情况下，活性肽分子量越小，其生物活性则越强[14]。蛋白肽作为蛋白质降解的中间产物，它的作用体现在以下2个方面：一方面它可以继续降解成氨基酸被肠道吸收利用以合成机体蛋白;另一方面它可以直接以小肽的形式被机体吸收利用，从而发挥更重要的生理功能。蛋白质在酶解时所用到的蛋白酶在水解过程中同样会产生许多小分子量的活性成分，这些小片段肽可能在机体内会具有特殊生理调节功能[15]。该研究通过分析西兰花茎叶蛋白酶解产物分子量分布，发现西兰花茎叶蛋白经碱酶酶解后，其主要成分为相对分子量3 000 Da以下的小分子肽，其中分子量1 000 Da以下组分占65.63%。已有研究表明，米糠蛋白[16]、羽扇豆蛋白[17]、大豆蛋白水解物[18]等植物蛋白源类物质有良好的降血脂活性。该试验为西兰花茎叶蛋白酶解物生理活性的研究奠定了基础，也为西兰花茎叶蛋白的高值化开发提供了参考。

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