基于微生物分离培养的3种甜菜土壤细菌多样性研究

李苗 杨福珍 武纤雨 闫海 刘洋

摘要通過传统微生物培养方法，对甜菜头茬土、根际土及迎际土的细菌群落结构多样性进行分析。结果表明，甜菜头茬土、迎茬土、根际土的细菌群落结构具有多样性。甜菜头茬土细菌含5个分类操作单元（operational taxonomic units，OTU），分属Proteobacteria、Actinobacteria类群，其中，第一优势属为Pseudarthrobacter，丰度为42.86%。甜菜根际土细菌含23个OTU，分属Firmicutes、Actinobacteria类群，其中，第一优势属为Bacillus，丰度为12.96%，第二优势属为Microbacterium，第三优势菌属为Planomicrobium和Streptomyces。甜菜迎茬土细菌含15个OTU，分属Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria类群，其中，第一优势属为Pseudarthrobacter，丰度为30.95%，第二优势属为Pseudomonas，第三优势菌属为Arthrobacter和Paenarthrobacter。这表明土壤的性质对土壤中细菌种类多样性具有一定的影响，不同性质土壤中细菌的OTU数目不同，且细菌群落结构也有所差异。这是首次以不同性质的甜菜土壤为试验材料研究甜菜土壤细菌种类多样性与土壤性质的关系。

关键词甜菜土壤;土壤细菌;可培养方法;物种多样性

中图分类号S 154.3文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0157-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.043

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Bacterial Diversity of Three Beet Soils Based on Microorganism Isolation and Culture

LI Miao，YANG Fu-zhen，WU Qian-yu et al（School of Chemical and Biological Engineering，University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083）

AbstractThe diversity of bacterial community structure in sugar beet new soil，rhizosphere soil and licking soil in the soil was analyzed by traditional microbial culture methods.Experiments have shown that the bacterial community structure of the beet new soil，liking soil and rhizosphere soil were diverse.The beet new soil bacteria contained five operational taxonomic units （OTU），belonging to the Proteobacteria and Actinobacteria groups.Among them，the first dominant genus was Pseudarthrobacter，and the abundance was 42.86%.The rhizosphere soil bacteria contained 23 OTUs，belonging to the Firmicutes and Actinobacteria groups.Among them，the first dominant genus was Bacillus，the abundance was 12.96%，the second dominant genus was Microbacterium，and the third dominant genus was Planomicrobium and Streptomyces.The sugar beet contained 15 OTUs，belonging to the group of Actinobacteria，Firmicutes and Proteobacteria.Among them，the first dominant genus was Pseudarthrobacter，the abundance was 30.95%，the second dominant genus was Pseudomonas，and the third dominant genus was Arthrobacter and Paenarthrobacter.The results showed that the nature of soil had a certain impact on the diversity of bacterial species in the soil.The number of OTUs in different soils was different，and the bacterial community structure was also different.This was the first time to study the relationship between bacterial species diversity and soil properties of sugar beet soils with different beet soils as experimental materials.

Key wordsSugar beet soil;Soil bacteria;Cultivable method; Species diversity

甜菜不仅是世界上主要的糖料作物也是我国主要糖料作物之一。甜菜生产在国民经济中占有重要地位，尤其在制糖业中起着举足轻重的作用，除用于制糖之外，还可以为动物饲料、生物燃料、人类营养和有机塑料提供许多增值的副产品[1-2]。甜菜具有耐旱、耐寒及耐盐碱等特点，是适应性和抗逆性都较强的作物[3]。目前发达国家已经利用科学手段来改变甜菜的根形和生物学特性，使甜菜的根产量和产糖率得到大幅度提升[4]，而我国仍面临甜菜产糖量低、生产成本较高、产业不稳定等问题[5]。

土壤微生物在土壤养分转化与腐殖质形成过程中起着重要作用[6]。土壤是微生物很重要的载体，是微生物生长和繁殖的天然培养基。土壤中存在丰富的微生物群落，包括各种病菌和有益的细菌，在维持土壤结构稳定性、土壤微生物多样性及生态平衡等方面均起到促进作用，是维持土壤生产力的重要指标[7-9]。土壤细菌含量在土壤微生物中占有绝对优势[10-11]，对废物的分解具有重要意义。除分解作用，还会产生一些有用的物质，可以促进土壤健康植物生长，其种类组成和群落结构在很大程度上决定土壤的生物活性，并在自然生态系统中保持平衡[12]。研究表明，细菌群落多样性与土壤理化性质、土壤类型和土壤上种植的作物均有密切关系[13]。

土壤微生物与植物密切互动，是影响植物健康的重要因素，土壤中的微生物可以直接影响其上植物的微生态[14-15]。土壤中一些很重要的土传病害可能成为传递给植物的致病因子，土壤中有益细菌对植物的健康生长发挥着重要的生物学作用[16]。虽然土壤微生物与植物的相关研究越来越多，但对甜菜与甜菜土壤微生物的研究相对较少[17-18]，且主要集中在甜菜育种、种植、栽培和营养成分糖分分析等方面，关于甜菜土壤微生物的相关研究目前很少[19-21]。

笔者以甜菜头茬土、迎茬土和根际土为试验材料，采用传统分离培养方法，开展其土壤细菌群落多样性研究，以获得丰富的甜菜土壤细菌资源，并研究与甜菜相关土壤中不同微生物的联系和差异，为进一步了解土壤与微生物之间的相互作用，筛选生防促生作用的有益细菌奠定基础，同时为实施土壤的干預、指导甜菜生产、提高甜菜的品质与产量提供科学依据，这对推进土壤微生物与植物关系的科学研究及甜菜产业发展具有重要的理论依据和实践意义。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1甜菜土壤样品的采集。

试验样品为内蒙古甜菜种植基地的3种甜菜土壤（不连作甜菜的头茬土和根际土，连作甜菜的迎茬土），于2018年10月采自内蒙古自治区鄂尔多斯市达拉特旗甜菜种植基地（109°54′55.92″E， 40°19′39.62″N），4 ℃ 保存。

1.1.2培养基及试剂。

LB、TSA、R2A成品培养基购于北京陆桥公司; 细菌基因 DNA 提取试剂盒及PCR相关试剂购于TIANGEN 公司，PCR引物由北京诺赛生物公司合成。

1.2试验方法

1.2.1土壤细菌的分离与纯化。

甜菜土壤细菌群落多样性研究采用传统分离培养技术。在超净工作台取2 g 土壤样品于50 mL 离心管，加20 mL 无菌水，采用梯度稀释法制备稀释倍数为1×10-2到1×10-7的系列稀释液。分别取稀释梯度为10-6 和10-7 的土壤稀释样品100 μL 涂布于 LB、TSA、R2A平板上，每个处理组设置3个平行，30 ℃ 培养 3 d后根据平板上菌落的形态 （ 表面光泽度、透明度、大小、颜色、形状、边缘整齐度等） 随机挑取具有代表性的单菌落，纯化后 4 ℃ 保存备用。

1.2.2内生细菌的 16S rDNA 序列分析 。

采用破碎法粗提取细菌基因组 DNA。用正向引物 27F （ 5′-AGAGT-TTCATCTGGCTCAG-3′） 和 反 向 引 物 1492R （ 5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′） 扩增细菌 16S rDNA。PCR 反应体系（ 50 μL） ： DNA 模板 3 μL、10×Buffer 5 μL、dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL、Taq 酶（ 5 U/L）0.25 μL、引物27F （10 mmol/L）1 μL、引物 1492 R （ 10 mmol/L） 1μL，最后用 ddH2O 补足至 50 μL。PCR 反应程序：94 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃ 变性 1 min，55 ℃ 复性 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，30 个循环后 72 ℃ 延伸 10 min。用1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。PCR 产物用 ABI 3730 型 DNA 测序仪进行测序。将测序得到的结果在 EZ biocloud中进行比对，确定与已知序列同源关系，当序列相似性达 98.65% 以上时归为同一 个种。

2结果与分析

通过传统分离培养方法从甜菜头茬土、根茬土和迎际土中分别挑取7、54、42株细菌，分别有5、23、15个代表菌株 （表1），将代表菌株序列信息提交到 GenBank，并获得登 录号。

由表1、2和图1可知，甜菜头茬土细菌群落分属2个类群：Proteobacteria类群（1个克隆，14.29%）、Actinobacteria类群（6个克隆，85.71%），其中Proteobacteria包含1个OTU，Actinobacteria包含4个OTU。该群落分属5个属，优势属（丰度）为Pseudarthrobacter（42.86%）。甜菜根际土细菌群落分属2个类群：Firmicutes类群（25个克隆，46.30%）、Actinobacteria类群（29个克隆，53.70%），其中Firmicutes包含12个OTU，Actinobacteria包含11个OTU。该群落分属16个属，优势属（丰度）为Bacillus（12.96%）、Microbacterium（9.25%）、Planomicrobium（7.41%）及Streptomyces（7.41%）。甜菜迎茬土细菌群落分属3个类群：Actinobacteria类群（27个克隆， 64.29%）、Firmicutes类群（7个克隆，16.66%）、Proteobacteria类群（8个克隆，19.05%），其中Actinobacteria包含8个OTU，Firmicutes包含3个OTU，Proteobacteria包含4个OTU。该群落分属11个属，优势属（丰度）为Pseudarthrobacter （30.95%）、Pseudomonas（11.90%）、Arthrobacter（9.52%）及Paenarthrobacter（9.52%）。甜菜头茬土共有5个OTU，根际土共有23个OTU，迎茬土共有15个OTU。甜菜根际土的OTU数目最多，其次是迎茬土，最后是头茬土。

甜菜头茬土、根际土和迎茬土有共同的菌属，如Pseudarthrobacter是头茬土的第一优势菌属，也是迎茬土的第一优势菌属，是根际土的第四优势菌属;Paenarthrobacter是头茬土的并列第二优势菌属，是根际土的并列第四优势菌属，也是迎茬土的并列第三优势菌属。除Pseudarthrobacter和Paenarthrobacter是3个甜菜土壤的共同菌属外，头茬土与根际土也有一些共同菌属Agrococcus和Sanguibacter;迎茬土与根际土也有一些共同菌属Arthrobacter、Brevibacterium、Microbacterium、Bacillus、Planomicrobium和Streptomyces。而Enterobacter菌属只在甜菜头茬土中分离得到，Pseudoclavibacter、Psychrobacter和Pseudomonas菌属只在迎茬土中分離得到，Exiguobacterium、Aerococcus、Paenibacillus、Enterococcus和Terribacillus菌属只在根际土中分离得到。

3讨论

土壤是植物生长的基质，为植物提供营养，同时也是土壤微生物的栖息地。土壤微生物群落与植物相互作用，参与植物基本的养分循环等过程，对维持植物的生产力起到重要作用[22-23]。土壤的表面和内部存在多种微生物，包括有益微生物和病原菌。目前对于土壤微生物的研究已经比较深入，但主要集中在被污染土壤的修复与整治[24-25]，对于农作物相关土壤微生物的研究主要是马铃薯[26]、黄瓜[27]、西瓜[28]、番茄[29]等作物，对甜菜土壤细菌群落结构多样性的研究较以上作物少。该研究以内蒙古培育的甜菜头茬土、迎茬土和受到土壤和甜菜共同影响的根际土为研究对象，通过传统微生物培养方法，对甜菜不同土壤细菌种类多样性进行研究，旨在揭示不同性质的甜菜土壤中细菌种类多样性的关系，为下一步进行土壤微生物干预提供科学依据。

该研究结果发现，不同甜菜土壤样品细菌群落结构具有多样性。甜菜头茬土细菌群落分属Proteobacteria、Actinobacteria 2个类群，5个菌属，具有 5个 OTU，第一优势菌属为Pseudarthrobacter（42.86%）;甜菜根际土细菌群落分属Firmicutes、Actinobacteria 2个类群，16个菌属，具有 23个 OTU，前 3 个优势菌属分别为Bacillus（12.96%）、Microbacterium （9.25%）、Planomicrobium（7.41%）及Streptomyces（7.41%）;甜菜迎茬土细菌群落分属Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria 3个类群，11个菌属，具有15 个OTU，前 3 个优势菌属分别为Pseudarthrobacter（30.95%）、Pseudomonas（11.90%）、Arthrobacter（9.52%）及Paenarthrobacter（9.52%）。来自甜菜头茬土的Enterobacter（14.29%）菌属为其特有;Exiguobacterium（3.70%）、Aerococcus（7.40%）、Paenibacillus（1.85%）、Enterococcus（1.85%）、Terribacillus（3.70%）、Cellulomonas（3.70%）是甜菜根际土中特有的菌属;Pseudoclavibacter（2.38%）、Psychrobacter（4.76%）和Pseudomonas（7.14%）菌属是迎茬土中特有的菌属。

该试验结果表明，从甜菜根际土中分离获得的细菌群落种类更多，细菌群落更具有多样性。Naz等[30]对根际微生物研究发现，根际土区域定居的细菌数量通常比土壤中发现的细菌多10～100倍。甜菜头茬土、根际土、迎茬土壤共有的Paenarthrobacter菌属是土壤中常见的菌属。Meng等[31]研究发现Paenarthrobacter nicotinovorans在土壤和极端环境中有很强的生存能力，现已广泛应用于降解尼古丁、脱硫、磷和重金属的去除污水、固氮作用等。

该试验结果表明甜菜头茬土中特有的Enterobacter菌属对土壤的健康和甜菜的健康生长起有益作用。研究发现，Enterobacter是植物生长促进细菌，可能在植物与微生物相互作用中起重要作用，因此在生物防治机制中起重要作用。这是由于Enterobacter cloacae CAL2的ACC脱氨酶基因具有促进植物生长特性，ACC脱氨酶基因表达后，通过水解过量的ACC来增强发芽，从而降低种子中乙烯的抑制水平来促进植物生长[32]。 Enterobacter agglomerans IC1270 可以同时产生几丁质水解酶和吡咯尼特林抗生素，对多种植物病原细菌和真菌均有较好的抗菌作用[33]。Enterobacter sp.P23也具有促进植物生长的作用，成功保护了盐胁迫下的水稻幼苗[34]。Agrococcus和Sanguibacter菌属为甜菜头茬土和根际土共有菌属，研究表明Agrococcus菌属成员能够在极端生存条件下茁壮成长，如在永久冻土环境中、极端碱性地中或极限环境[35]。Park等[36]研究发现Sanguibacterantarcticus KOPRI 21702可以产生具有很强冷适应性的几丁质水解酶。甜菜迎茬土中特有的Psychrobacter菌属对抗生素具有一定的抗性。Psychrobacter psychrophilus在冻土中分离出来，研究表明其对四环素和链霉素具有抗性[37];另外甜菜迎茬土中特有的Pseudomonas属存在一定的致病性。黄其玲等[38]在研究猕猴桃溃疡病菌的生物学特性时发现Pseudomonas syringae pv.actinidiae所引起的猕猴桃溃疡病是生产中最具毁灭性的细菌病害之一，是我国林业上的检疫性病害。

4结论

这是首次用传统分离培养方法研究内蒙古甜菜的头茬土、根际土和迎茬土壤细菌群落多样性，对推进土壤科学研究及甜菜产业发展具有积极的理论与实践价值，为进一步挖掘土壤微生物与植物之间的互作关系提供参考依据，为实施土壤的干预、指导甜菜生产、提高甜菜的品质与产量提供微生态的科学依据。该试验首次分离到的内蒙古甜菜土壤细菌资源，为今后合理开发新的植物益微菌剂奠定资源基础。

参考文献

[1]韩秉进，朱向明.我国甜菜生产发展历程及现状分析[J].土壤与作物，2016，5（2）：91-95.

[2]兴旺，崔平，潘荣，等.不同国家甜菜种质资源遗传多样性研究[J].植物遗传资源学报，2018，19（1）：76-86.

[3]李智.膜下滴灌甜菜水氮耦合的生理效应[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2018.

[4]劉升廷，王燕飞，高卫时，等.对我国甜菜种业发展的思考[J].中国糖料，2017，39（2）：71-74.

[5]MARINELLO F，PEZZUOLO A，CILLIS D，et al.Traffic effects on soil compaction and sugar beet （Beta vulgaris L.） taproot quality parameters[J].Spanish journal of agricultural research，2017，15（1）：1-8.

[6]崔金香，王帅.土壤微生物多样性研究进展[J].河南农业科学，2010（6）：165-169.

[7]钱叶，侯怡铃，邱洁，等.龙门山地震带土壤细菌多样性的研究[J].土壤通报，2017，48（5）：1093-1101.

[8]郭金瑞，宋振伟，朱平，等.长期不同种植模式对东北黑土微生物群落结构与土壤理化性质的影响[J].土壤通报，2016，47（2）：353-359.

[9]KIRK J L，BEAUDETTE L A，HART M，et al.Methods of studying soil microbial diversity[J].Journal of microbiological methods，2004，58（2）：169-188.

[10]DELMONT T O，PRESTAT E，KEEGAN K P，et al.Structure，fluctuation and magnitude of a natural grassland soil metagenome[J].The ISME Journal，2012，6（9）：1677-1687.

[11]FIERER N，LEFF J W，ADAMS B J，et al.Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes[J].Proceedings of the national academy of sciences，2012，109（52）：21390-21395.

[12]NACKE H，THRMER A，WOLLHERR A.Pyrosequencing-based assessment of bacterial community structure along different management types in German forest and grassland soils[J].PLoS One，2011，6（2）：1-12.

[13]NICOMRAT D，DICK W A，DOPSON M，et al.Bacterial phylogenetic diversity in a constructed wetland system treating acid coal mine drainage[J].Soil biology and biochemistry，2008，40（2）：312-321.

[14]KIM Y C，LEVEAU J，MCSPADDEN GARDENER B B，et al.The multifactorial basis for plant health promotion by plant-associated bacteria[J].Applied and environmental microbiology，2011，77（5）：1548-1555.

[15]SANTHANAM R，LUU V T，WEINHOLD A，et al.Native root-associated bacteria rescue a plant from a sudden-wilt disease that emerged during continuous cropping[J].Proceedings of the national academy of sciences，2015，112（36）：5013-5020.

[16]李南南，刘洋，赵燃，等.北京优质杂交玉米种子内生细菌种类多样性[J].食品科学技术学报，2016，34（5）：55-63.

[17]VALENCIA E，GROSS N，QUERO J L，et al.Cascading effects from plants to soil microorganisms explain how plant species richness and simulated climate change affect soil multifunctionality[J].Glob Chang Biol，2018，24（12）：5642-5654.

[18]SHI W C，LI M C，WEI G S，et al.The occurrence of potato common scab correlates with the community composition and function of the geocaulosphere soil microbiome[J].Microbiome，2019，7（1）：1-18.

[19]HASSANI M，HEIDARI B，DADKHODAIE A，et al.Genotype by environment interaction components underlying variations in root，sugar and white sugar yield in sugar beet （Beta vulgaris L.）[J].Euphytica，2018，214：1-21.

[20]JACOBS A，KOCH H，MAERLAENDER B.Using preceding crop effects for climate smart sugar beet （Beta vulgaris L.）cultivation[J].Europenan journal of agronomy，2019，104：13-20.

[21]BARONE V，BAGLIERI A，STEVANATO P，et al.Root morphological and molecular responses induced by microalgae extracts in sugar beet （Beta vulgaris L.）[J].Journal of applied phycology，2018，30（2）：1061-1071.

[22]LELOUP J，BAUDE M，NUNAN N，et al.Unravelling the effects of plant species diversity and aboveground litter input on soil bacterial communities[J].Geoderma，2018，317：1-7.

[23]SCHMID M W，HAHL T，VAN MOORSEL S J，et al.Rhizosphere bacterial community composition depends on plant diversity legacy in soil and plant species identity[J/OL].bioRxiv，2018：1-37[2019-01-25].https：//www.biorxiv.org/content/early/2008/03/23/287235.full.pdf.doi：https：//doi.org/10.1101/287235.

[24]CAO B，ZHANG Y，WANG Z Y，et al.Insight into the variation of bacterial structure in atrazine-contaminated soil regulating by potential phytoremediator： Pennisetum americanum（L.） K.Schum.[J].Frontiers in microbiology，2018，9：1-11.

[25]LIU Z C，WANG L A，DING S M，et al.Enhancer assisted-phytoremediation of mercury-contaminated soils by Oxalis corniculata L.，and rhizosphere microorganism distribution of Oxalis corniculata L.[J].Ecotoxicology and environmental safety，2018，160：171-177.

[26]呂昭和，唐德华.马铃薯连作栽培对土壤微生物多样性的影响[J].农业工程技术，2018，38（23）：24-27.

[27]秦立金，徐峰，刘永胜，等.黄瓜与西芹间作土壤细菌多样性及其对黄瓜枯萎病发生的影响[J].中国生态农业学报，2018，26（8）：1180-1189.

[28]吴宇佳，吉清妹，解钰，等.西瓜连作土壤细菌种群消长变化[J].中国瓜菜，2018，31（11）：18-21.

[29]孙文庆，康亚龙，刘建国，等.加工番茄连作对土壤微生物群落多样性的影响[J].西北农业学报，2017，26（7）：1099-1110.

[30]NAZ S A，JABEEN N，SOHAIL M，et al.Production and purification of pyocin from a soil associated Pseudomonas aeruginosa strain sa 188[J].Pakistan journal of agricultural sciences，2015，52（4）：873-887.

[31]MENG J，SUN X M，LI S S，et al.Draft genome sequence of Paenarthrobacter nicotinovorans Hce-1[J].Genome announcements，2017，5（30）：717-727.

[32]KAMPFER P，MCINROY J A，GLAESER S P.Enterobacter muelleri sp.nov.，isolated from the rhizosphere of Zea mays[J].Int J Syst Evol Microbiol，2015，65（11）：4093-4099.

[33]NIE L，SHAH S，RASHID A，et al.Phytoremediation of arsenate contaminated soil by transgenic canola and the plant growth-promoting bacterium Enterobacter cloacae CAL2[J].Plant physiology and biochemistry，2002，40（4）：355-361.

[34]SARKAR A，GHOSH P K，PRAMANIK K，et al.A halotolerant Enterobacter sp.displaying ACC deaminase activity promotes rice seedling growth under salt stress[J].Res Microbiol，2018，169（1）：20-32.

[35]BEHRENDT U，SCHUMANN P，ULRICH A.Agrococcus versicolor sp.nov.，an actinobacterium associated with the phyllosphere of potato plants[J].Int J Syst Evol Microbiol，2008，58（Pt 12）：2833-2838.

[36]PARK H J，KIM D，KIM I H，et al.Characteristics of cold-adaptive endochitinase from Antarctic bacterium Sanguibacter antarcticus KOPRI 21702[J].Enzyme and microbial technology，2009，45（5）：391-396.

[37]PETROVA M，GORLENKO Z，MINDLIN S.Molecular structure and translocation of a multiple antibiotic resistance region of a Psychrobacter psychrophilus permafrost strain[J].FEMS Microbiol Lett，2009，296（2）：190-197.

[38]黃其玲，高小宁，赵志博，等.GFPuv标记猕猴桃溃疡病菌的生物学特性及其在土壤、根系中的定殖[J].中国农业科学，2013，46（2）：282-291.