虹鳟HMGCR基因克隆及组织差异表达分析

陈路斯 王震 张剑伟 张新党 王恒志 林贝贝 邓君明

摘要[目的]闡述虹鳟β-羟-β-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）基因的mRNA序列，并比较其在虹鳟不同组织器官中的表达差异。[方法]通过PCR技术扩增虹鳟HMGCR基因的mRNA序列，采用荧光定量PCR技术，比较HMGCR基因在虹鳟肝脏、肠道、胃、心脏、鳃、脾脏、肾脏、肌肉8种组织器官中的表达差异。[结果]虹鳟HMGCR基因的mRNA序列与大西洋鲑的同源性达97%，其蛋白序列与脊椎动物的同源性都在70%以上，表明该基因在物种进化过程中比较保守;该基因在虹鳟肝脏、肠道、胃、心脏、鳃、脾脏、肾脏、肌肉8种组织器官中均有表达;其中，该基因在肝脏和心脏中的表达量较高，而在胃中的表达量最低。[结论]该研究克隆出虹鳟胆固醇合成关键限速酶HMGCR的部分mRNA序列，分析了该基因在不同组织中的表达情况，为该酶的深入研究奠定基础。

关键词虹鳟;HMG-CoA还原酶;基因克隆;组织差异表达;荧光定量PCR

中图分类号S 917.4文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0095-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.024

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Tissue Differential Expression Analysis of HMGCR Gene in Oncorhynchus mykiss

CHEN Lu-si，WANG Zhen，ZHANG Jian-wei et al（College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kun-ming，Yunnan 650201）

Abstract[Objective]The purpose of this study was to reveal the mRNA sequence of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase （HMGCR） and compare the gene expression levels in different tissues of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）.[Method]The partial sequence of HMGCR gene was amplified by PCR technology and the gene expression differences among tissues such as liver，intestine，stomach，heart，gill，spleen，kidney and muscle were revealed by fluorescence quantitative PCR technology.[Result]The amino acid sequence shared 97% homology with Salmo salar，and the deduced protein sequence shared more than 70% homology with vertebrate，indicating that the gene was more conservative in the process of species evolution.The gene expression could be detected in the liver，intestines，stomach，heart，gill spleen，kidney and muscle of rainbow trout.The expression level of HMGCR gene in liver and heart was the highest，whereas which was the lowest in the stomach.[Conclusion]We cloned the partial RNA sequence of HMGCR，a key rate-limiting enzyme for cholesterol synthesis in rainbow trout，and analyzed the expression of HMGCR in different tissues，which laid a foundation for further study of the enzyme.

Key wordsOncorhynchus mykiss;HMGCR;Gene cloning;Tissue differential expression;Real-time PCR

胆固醇是一种以环戊烷多氢菲为母体的固醇类衍生物，主要以游离胆固醇和胆固醇酯的形式存在于动物组织细胞中。胆固醇不仅是构成生物膜的重要成分，同时也是生物体内合成多种类固醇激素与维生素D的前体，还可以作为胆汁酸生物合成的原料[1-3]。然而，不同动物合成胆固醇的能力存在显著差异，虾蟹等甲壳动物不具备自身合成胆固醇的能力[4-5]，其体内胆固醇必须从外界摄取;大部分脊椎动物体内胆固醇主要来自于组织细胞的自身合成[6]。胆固醇合成可分为3个阶段：碳单位甲羟戊酸合成、鲨烯合成、胆固醇生成[7]。乙酰CoA是胆固醇合成的直接原料，主要来自于葡萄糖、脂肪以及某些氨基酸的代谢，其中TCA循环是直接供给途径[8]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原生成甲羟戊酸是胆固醇合成的限速步骤，其中催化HMG-CoA发生还原反应的β-羟-β-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）是这一步骤的关键酶，也是内源性合成胆固醇的关键限速酶[9]，其活性将直接影响着胆固醇的合成速度。

HMGCR基因表達与酶活性受激素水平的调控[10]。试验表明，甲状腺激素[11]、胰岛素[12]可以提高HMGCR基因的转录水平，而胰高血糖素则会降低该基因的转录[13]。糖皮质激素和雌激素通过影响HMGCR的稳定性来调节胆固醇的合成量[6]。HMGCR酶活性除受到激素影响外，还受自身胆固醇含量的反馈调节[14]。当细胞中胆固醇含量较高时，会抑制该酶活性，从而减少内源性胆固醇生成量。过高胆固醇含量也会加快该酶的降解，使细胞内胆固醇含量达到平衡，这种降解反应依赖于跨膜区的泛素蛋白酶途径[15]。与此相反，当细胞中胆固醇含量较低时，该酶活性就会被激活，从而促进内源性胆固醇生成。体外试验表明，胆固醇能在转录水平上调节HMGCR[15]，当细胞中胆固醇含量较低时，内质网上的SCAP/SREBP复合物在SCAP护送下进入高尔基体复合体，在位点1蛋白酶和位点2蛋白酶的作用下，该复合物释放SREBP前体，SREBP进入细胞核中，并与固醇反应元件结合，从而促进HMGCR基因的转录;当细胞中胆固醇含量较高时，SREBP只能停留在内质网上，无法进入细胞核中，同时那些已经进入到细胞核中的SREBP也会被分解，无法与固醇反应元件结合，从而阻止HMGCR基因的转录[16-17]。研究表明，不同动物的调节方式可能不同，有些是在翻译水平上调节（如大鼠），有些则是在转录水平上调节（如仓鼠和 小鼠）[17]。

大量研究表明，胆固醇合成代谢与鱼类健康有着密切关系[1]。HMGCR作为合成内源性胆固醇的关键限速酶，越来越引起人们的关注。目前，人、鼠、鸡、鸭、鹅等陆生动物以及斑马鱼、草鱼等水生动物HMGCR基因序列已被成功克隆[18-19]。该研究应用PCR方法克隆出虹鳟胆固醇合成关键限速酶HMGCR的部分mRNA序列，旨在为该酶的深入研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料试验用虹鳟（Oncorhynchus mykiss）来自当年人工培育的同一批苗种，同种饲料饲喂。随机选取3条规格一致（80 g左右）虹鳟，于超净工作台中采集肝脏（Hep）、肠道（Int）、胃（Sto）、脾脏（Spl）、肾脏（Kid）、肌肉（Mus）、鳃（Gil）、心脏（Hea）8种组织，装入用0.1%DEPC水溶液预处理过的冻存管中，快速投入液氮中，保存备用。

1.2试验方法

1.2.1RNA提取及反转录。使用RNA提取试剂（Trizol Reagent）提取总RNA。试验过程中应严格防止RNase污染。采用1.0%琼脂糖电泳检测其完整性，Nano Vue微量紫外分光光度计检测浓度和纯度。为除去总RNA中所掺杂的基因组DNA，取1 μL总RNA，加入2 μL 5×DNA Eraser Buffer，用RNase Free dH2O补足至反应体系为10 μL，42 ℃下反应 2 min后置于4 ℃中保存。取10 μL上述反应液，加入4 μL  5×Prime script buffer、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix和 1 μL RT primer Mix，用RNase Free dH2O补足反应体系至 20 μL，37 ℃下反转录15 min，合成cDNA，85 ℃下反应5 s后于4 ℃条件下保存。

1.2.2简并引物的PCR扩增及产物测序。根据NCBI网站GenBank数据库中大西洋鲑（Salmo salar）（NP001167390.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（AEO44579.1）、欧洲鲈（Dicentrarchus labrax）（AAR02862.2）和斑马鱼（Danio rerio）（AAI55136.1）4个物种的核酸序列，利用引物在线设计软件CODEHOP（http：//blocks.fhcrc.org/codehop.html）设计简并引物。经Blast比对后，挑选简并度较低的引物送交上海生工生物工程股份有限公司进行合成。以HMGCR-U1和HMGCR-D1为引物（表1），进行PCR扩增。RCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒（Gel Extraction UF Kit）进行切胶回收。取纯化后的PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将扩增到的序列在NCBI网站上进行BLAST比对，并对其序列进行生物信息学分析。根据简并引物PCR扩增到的片段在NCBI网站中的Blastn比对结果，得到第一段mRNA序列。参考大西洋鲑mRNA序列，设计同源引物HMGCR-F1和HMGCR-R1（表1），进行PCR扩增取纯化后PCR产物送至深圳华大基因进行测序。将得到的结果在NCBI网站上进行BLAST比对，得到第2段mRNA序列。借助DNASTAR Lasergene7生物软件，对所得2个片段进行合并，并对合并后的片段进行生物信息学分析。

1.2.3各组织HMGCR表达量的测定。利用Trizol（Invitrogen）法提取虹鳟肝脏（Hep）、肠道（Int）、胃（Sto）、脾脏（Spl）、肾脏（Kid）、肌肉（Mus）、鳃（Gil）、心脏（Hea）8种组织总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA第一模板链，作为荧光定量PCR模板，根据已获得的HMGCR基因序列，借助生物软件DNASTAR Lasergene7 PrimerSelect设计并筛选HMGCR SYBR Green Ⅱ 实时荧光实时定量 PCR引物，以β-actin为内参，进行相对定量（表2）。荧光定量 PCR 采用 SYBR Green Ⅱ 嵌合荧光法，所用试剂为SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time，TaKaRa，日本），反应在Thermal cycler （Mastercycler ep realplex，Eppendorf，德国）仪器中进行。PCR反应体系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，cDNA 1 μL，上下游特异性引物（10 mmol/L）各1 μL，DEPC-H2O 7 μL。荧光定量PCR反应程序如下：95 ℃预变性2 min;94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火35 s，72 ℃延伸40 s，40个循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以β-actin为内参，其中内参其因的退火温度为60 ℃。每个组织设3个平行组，基因相对mRNA水平采用 2-ΔΔCt法检测。所有试验数据均以平均值±标准误表示。采用单因素方差分析（ANOVA），当各处理组间存在显著差异（P<0.05）时，采用Duncans检验进行多重比较分析。数据统计与分析均使用SPSS 17.0统计软件进行。

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