鸡源巴氏杆菌的分离鉴定及致病性研究

秦晓冰

摘要从青岛农业大学动物医院的蛋鸡送检病料中，无菌采集病死鸡肺脏、肝脏组织进行细菌的分离培养和鉴定，并对鉴定的分离菌进行药敏试验和致病性试验。结果表明，分离菌在血琼培养基上呈圆隆、露滴状、表面光滑带荧光的白色菌落，染色镜检为革兰氏阴性短杆菌，经PCR鉴定该菌为多杀性巴氏杆菌;该菌对氟苯尼考、阿米卡星高度敏感，对头孢曲松、头孢氨苄、阿莫西林等13种药物表现出不同程度耐药;该菌对小鼠呈高致死性，表明该菌具有很强的致病性。

关键词鸡源多杀性巴氏杆菌;分离;鉴定;致病性

中图分类号S 831.7文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0088-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.021

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Identification of Pasteurella multocida from Chicken and Its Pathogenicity Research

QIN Xiao-bing（Shandong Key Laborary of Preventive Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

AbstractThe lungs and liver tissues of dead laying hens were collected from the animal hospital of Qingdao Agricultural University under sterile conditions to make pathogen isolation，culture and identification.And the drug sensitivity test and pathogenicity test were carried out on the identified and isolated bacteria. The results showed that the isolated bacteria were round，dripping，smooth surface and white colonies with fluorescence on the blood-agar medium，and the isolated bacteria were Gram-negative small bacterium by staining and microscopic examination，and they were identified as Pasteurella multocida by PCR. The isolated strain was highly sensitive to florfenicol and amikacin，and had different drug resistance to ceftriaxone，cephalexin，amoxicillin and other 10 drugs.Furthermore，the isolated strain was highly pathogenic to mice，showing stronger pathogenicity.

Key wordsP.multocida from chicken;Isolation; Identification;Pathogenicity

多殺性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属，是革兰氏阴性小杆菌[1]。Pm引起鸡的出血性败血症，又称禽霍乱，是以病鸡出现肠道出血、败血症和关节炎为主要特征，发病率和死亡率都非常高的禽重要传染病之一[2]。Pm存在于禽类的上呼吸道，当遇到环境应激或者动物机体抵抗力降低时会诱发该病。

禽巴氏杆菌病在临床诊断上主要分为最急性型、急性型、慢性型。其中，最急性型常表现为无任何前驱症状，突然倒地，很快死亡，剖检无特殊病变;急性型最为常见，主要表现为败血症，发病率高、死亡率高;慢性型主要表现为鼻窦肿大、肉髯显著肿大、关节炎等，病死率较低，病例剖检的变化常因侵害器官不同而异[3-5]。Pm的发生给养禽业带来了不同程度的损失，也给禽产品带来了食品安全问题，加强对多杀性巴氏杆菌的研究对于保护养禽业的健康和可持续发展具有重要意义。

1材料与方法

1.1病料与实验动物

病料来自于青岛农业大学动物医院的某蛋鸡养殖场送检病死鸡，无菌采集其肺脏、肝脏等器官组织。昆明小鼠购自青岛派特福德养殖专业合作社。

1.2主要试剂

犊牛血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，琼脂等培养基购自生工生物工程（上海）股份有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），购自天根生化科技有限公司。DNA Marker、DNA 纯化回收试剂盒均购自宝日医生物技术有限公司，琼脂糖凝胶购自北京陆桥技术有限责任公司。药敏试纸购自杭州天和微生物有限公司，其他试剂和染色液均由山东省预防兽医学重点实验室提供。

1.3细菌的分离培养与染色镜检

无菌采集病死鸡病料肺脏、肝脏等组织分泌物，接种于血清琼脂培养基，置于37 ℃恒温箱培养24 h，观察菌落生长状态;选取单个菌落进行革兰氏染色并镜检，观察其形态特征，并对疑似菌落进行纯化培养。

1.4PCR鉴定

1.4.1引物设计与合成。

根据GenBank数据库登录的Pm的 Kmt基因，设计1对引物：

Kmt-P1为5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGC-3，Kmt-P2为5-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCGT-3。引物由北京百盛生物公司合成，预期产物长度为457 bp。

1.4.2Kmt 基因的扩增与鉴定。

取Pm菌液1 mL，离心后取上清液为模板，用Kmt-P1和Kmt-P2进行扩增。PCR体系（25 μL）：P1、P2、DNA模板各1 μL，ddH2O 14.75 μL，10×Buffer和MgCl2各2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，Taq酶0.25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃  45 s，55 ℃45 s，72 ℃  45 s，共30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行回收。

1.5药敏试验

采用纸片-琼脂扩散法对分离菌进行药敏试验，将含有分离菌的肉汤培养液涂布于血琼培养基，置于恒温箱孵育1 h，取出将药敏纸片贴于培养基表面，37 ℃条件下过夜，测量抑菌圈直径。

1.6动物试验

从纯化培养24 h的血清琼脂平板中挑选6个单菌落，分别无菌接种于含犊牛血清的肉汤培养液中，置于37 ℃、200 r/min的摇床中振荡24 h。用移液器向新洁净离心管中加入180 μL灭菌生理盐水并从原离心管中吸取 20 μL的菌液，混匀后稀释成1∶10的菌液，按上述操作配制成浓度以10倍递减的菌液。吸取100 μL的各稀释菌液移入不同血清琼脂培养基中涂布，置于37 ℃恒溫箱中培养 24 h，菌落长出后计数。菌液活菌数（CFU/mL）=所选平板菌落 数×稀释倍数×10，计算结果与标准值（2.5× 108 CFU/mL）进行比较。选择2组活菌数与标准值相近的菌液，分为 Ⅰ 组和 Ⅱ 组，每组皮下接种6只7日龄的健康小鼠，剂量为 1 mL/只;另外3只小鼠作为对照组（CK），接种生理盐水，剂量为1 mL/只，正常给水给料，饲养24 h后观察临床症状及死亡率，并对分离菌进行鉴定。

2结果与分析

2.1分离菌的培养特性

用病死鸡肝脏和肺脏组织分别进行细菌分离与培养，该分离菌在麦康凯培养基上不生长，在血清琼脂培养基上培养24 h后形成圆隆、露滴状、表面光滑的半透明白色菌落，45°折光下可见有淡蓝色荧光，不溶血，革兰氏染色镜检可见菌体钝圆，呈阴性的短杆菌（图1）。该分离菌与多杀性巴氏杆菌的分离培养特性一致。

2.2Kmt基因的扩增结果Kmt基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段小于500 bp，与预期结果相符（图2）。测序后登录NCBI网站进行Blast同源性比对，分离菌与Pm菌株的同源性为99.6%，进一步证实该菌为多杀性巴氏 杆菌。

2.3药敏试验结果

药敏试验结果表明，分离菌对青霉素、头孢曲松、头孢氨苄、阿莫西林、新霉素、卡那霉素、多西环素、阿奇霉素等13种抗生素表现出不同程度的耐药，对红霉素、氧氟沙星、庆大霉素中度敏感，对氟苯尼考、阿米卡星高度敏感。根据多重耐药的判定原则，该菌株对2类以上的抗生素同时耐药，判定该菌株为多重耐药菌株。

2.4动物试验结果

相同浓度的2种菌液腹部皮下注射小鼠后，Ⅰ、Ⅱ 组试验小鼠24 h内死亡11只，Ⅰ 组 6只全部死亡，Ⅱ组死亡5只，活着的一只小鼠眼部出血，对照组（CK）小鼠正常。对12只小鼠进行剖检，可见肺脏出血（12/12），肝脏和脾脏出血、肿胀（12/12），肾脏和心脏表明有出血点（11/12）。经鉴定从试验死亡小鼠肺脏中分离到与原分离菌相一致的巴氏杆菌，表明分离菌与多杀性巴氏杆菌致死小鼠的症状一致，且该菌具有较强的致病力。

3讨论

Pm可以在家禽的上呼吸道和消化道存在，是一种条件性致病菌，当鸡舍内产生气温骤变、通风不良等应激因素，或者鸡感染其他疫病造成机体抵抗力下降时，容易诱发该菌的繁殖，引起禽霍乱的发生[6]。该病在临床上发生经常有其他诱发因素，特别是疫病的诱发，常常伴随着败血支原体、大肠杆菌病和沙门氏菌等发生多重混合感染[7]。Pm往往容易被忽略，此次从病料中分离的细菌中就含有大肠杆菌。实验室在其他蛋鸡送检病料中，也多次分离到Pm，说明在规模化蛋鸡养殖场中Pm依然存在，有潜在的发病风险。

Pm容易产生耐药性，该试验中分离的菌株对青霉素、头孢氨苄、阿莫西林、多西环素、阿奇霉素等13种抗生素表现出不同程度的耐药，这与许多研究报道[8-10]相一致。建议鸡场不要盲目滥用抗生素药物，临床不发病时，不要用抗生素;发病时，尽量用中草药或者益生素代替抗生素;不得不用时必须要遵守《兽医使用规范》，并且是2种不同的抗生素交叉使用。发生疫病时，要先进行药敏试验，选择敏感的药物进行治疗，并且要隔离病鸡，加强消毒，将疫情消灭在萌芽状态。

参考文献

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