果上叶中白杨素的含量测定

李明娟，李庚喜，朱琪

(邵阳学院 药学院,湖南 邵阳,422000)

果上叶(bulbophyllum odoratissimum，Lindl),别名羊奶果、极香石豆兰、石串莲，为兰科植物云南石仙桃(pholidota yunnanensis，Rolfe)的干燥根状茎和假鳞茎[1]。它是土家族、苗族的民间常用药物，具有行气止痛、润肺化痰的功效,用于治疗多种炎症效果较好，如肺结核咳嗽、咯血，慢性气管炎，慢性咽炎，疝气疼痛，月经不调，疮疡肿痛等慢性炎症[2]。对于果上叶的化学成分的研究目前较少，已有研究报道果上叶含有黄酮类化合物主要为白杨素(chrysin)和短叶松黄烷酮(pinobanksin)等[3]。其中白杨素在多种药物中发挥了抗氧化、抗病毒的作用，该类化合物在植物中分布广泛，毒性比较低，是近年来新药开发研究中一个非常重要的资源[4]。因此，对果上叶白杨素成分的分析，对研究果上叶的药用部位和药用价值具有指导意义，可为进一步开发该药物奠定基础。国内外分析植物中白杨素成分的方法，主要为先提取分离，再采用紫外分光光度法、光谱方法和高效液相色谱法来定性和定量分析。高效液相色谱法用于成分分析，具有定量准确，灵敏度高、重复性好等优点[5-6]。本课题通过研究建立了高效液相色谱法测定果上叶中白杨素含量的方法，为果上叶质量控制方法的建立提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药

Waters2695高效液相色谱仪，含四元梯度泵、自动进样器；万分之一电子分析天平(Sartorius 公司)；UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；锐思捷超纯水机Unique系列(南京伊若达仪器设备有限公司)；超声波清洗器KQ3200B型(昆山市超声仪器公司)；白杨素对照品(南京泽朗医药科技有限公司，批号ZL20150815N);甲醇为色谱纯由天津科密欧化学试剂公司提供，其它试剂为分析纯；液相用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 检测波长的选择

为确定白杨素标准品的最佳吸收波长扫描，应用紫外-可见分光光度计在190～400 nm波长范围内对白杨素标准溶液进行扫描，发现其在220 nm 波长处具有最大吸收，因此，高效液相色谱检测波长选定为220 nm。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：以Agilent Eclipse XDB-C 18(4.6 mm×250 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(30∶70)，流速为1.0 mL/min，检测波长为220 nm；柱温为室温30 ℃，进样量为10 μL。在此色谱条件下获得对照品溶液、样品溶液及阴性样品溶液的色谱图如图1、2、3所示。

图1 白杨素对照品溶液高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of chrysin substance standard

图2 民族药果上叶供试品溶液高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of test sample with Bulbophyllum odoratissimum

图3 阴性样品溶液高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of negative sample

1.2.3 溶液的制备

精密称取五氧化二磷干燥至恒重的白杨素对照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，加水至刻度，摇匀，制得对照品贮备液，精密量取贮备液1 mL置10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

称取果上叶干燥粉末200 g，按照料液比 1∶30 加入60%的乙醇，于 60 ℃加热回流提取2 h，提取2次，采用旋转蒸发仪回收溶剂，得浸膏，用水分散后，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇采用索式萃取器分别提取，取正丁醇部分经硅胶柱色谱分离、乙酸乙酯-丙酮梯度洗脱，洗脱液再进行硅胶柱纯化，以乙酸乙酯-正丁醇-甲醇(2∶2∶1)为洗脱剂，得供试品溶液，旋干得供试品。以甲醇为溶剂，将供试品配制为1 mg/mL的溶液，取供试品与标准品的甲醇溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-丁酮(9.4∶0.3∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中检视，两者在相应位置出现相同颜色斑点[7-8]，可确认该供试品为白杨素[9]。供试品溶液用 0.45 μm 微孔滤膜滤过后，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，其色谱见图1。

1.2.4 线性与范围

按照1.2.3项下制得的对照品贮备液，精密量取1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。依照上述高效液相色谱法条件记录峰面积，各进样10 μL。以白杨素对照品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性分析，得回归方程Y=968 758X+1 521，r=0.998 9。

1.2.5 精密度实验

精取白杨素对照品溶液，重复3 d进样，每日重复进样5次，记录峰面积，以测定其日内精密度和日间精密度。计算待测峰峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.6 稳定性实验

精取同一供试品溶液，在配制后室温放置0、2、4、6、12、24 h分别进样1次，计算峰面积RSD。

1.2.7 重复性实验

取同批样品，按“1.2.3”项下制备供试品溶液 6 份，分别按上述的色谱条件重复进样,每份平行测定两次，并计算各份的白杨素含量，其RSD为1.68%，重现性良好。说明方法的重复性良好。

1.2.8 回收率实验

取同一批号的民族药果上叶样品，含量为0.039 2%，按上述1.2.3方法制备供试品溶液按上述色谱条件分离、测定，计算回收率。

1.2.9 样品的含量测定及结果

取不同批次的5批民族药果上叶，每批称取1.0 g各3份，精密称定，按上述1.2.3方法制备供试品溶液并测定白杨素含量。

2 结果

线性回归分析结果显示，白杨素在测定浓度为10～100 μg/mL的范围内与其峰面积具有良好的线性关系。精密度实验结果显示，日内精密度RSD为1.12%，日间精密度RSD为2.09%，说明仪器的精密度良好。稳定性实验结果显示，峰值面积RSD为1.25%，说明样品溶液的稳定性良好。回收率实验结果见表1，该方法回收率良好，准确率较高，可行性较好。5批样品含量测定结果见表2。

表1 加样回收率实验结果(n=6)Table 1 Samping recouery test results(n=6)

表2 5批样品含量测定的结果Table 2 Results of content determination in five test samples

3 讨论

白杨素系黄酮类化合物，是新药开发研究中一个非常重要的资源。但目前，对果上叶黄酮类化合物的分离几乎未见文献报道，并由于果上叶白杨素的含量低的原因，要对白杨素分离、纯化比较困难，本实验参照文献，经过多次预实验，分离条件的探索[10],最终发现，首先经过有机溶剂提取黄酮类有效成分、硅胶柱初步纯化分离和高效液相色谱的进一步分离方法，对白杨素单体化合物的分析具有可行性。在分离条件探索中，曾对流动相比例乙腈-0.1%磷酸水溶液不同比列进行了预实验[10-11]，发现乙腈所占比列低于20%时，白杨素与杂质峰的分离较好，但白杨素的保留时间较长，所以综合考虑，调整流动相的比例，其中乙腈-0.1%磷酸水溶液以30∶70的混合比例，其保留时间和各杂质峰的分离度满足要求，出峰时间亦相对较为合适，故将调整过后的流动相列入分离条件。并经过一系列的方法学考察，证明该方法操作方便，分离效果好、精密度和重现性高，稳定性好；测量结果准确、可靠，能为果上叶白杨素的质量研究提供参考依据，同时也为果上叶中其他黄酮类化合物的分离与分析提供参考。果上叶制剂如岩果止咳蜜制剂的质量控制方法亦未见文献报道，可进一步作为其有效成分研究分析的依据。

本研究建立了果上叶白杨素的含量测定方法，该方法操作简便、准确、灵敏，可用于果上叶的白杨素质量控制方法的建立提供参考依据 。