幼年期实验用食蟹猴血液学指标测定与比较

何钢华，廖金娥，陈结文，黄庆宇，罗 群，吴志恒，陈梅丽，卢 丽*

(1.广州春盛生物研究院有限公司，广州 510900； 2.广东省实验动物监测所(广东省实验动物重点实验室)，广州 510663)

非人灵长类实验动物与人类的遗传物质有75%～98.5%的同源性[1]，在系统发育上与人类接近，在生理学、解剖学、免疫学以及神经学方面有许多相似之处[2]，是研究人类健康和疾病的理想实验动物，其生物学特性对药理学、毒理学及药物安全性评价等方面的研究具有重要的意义[3]。广东省非人灵长类实验动物存量达80 000只，占全国总存量1/3，以食蟹猴为主，每年出口欧美的标准化实验猴数量超过6000只[4]，丰富的实验猴资源，是研究人类相关疾病及毒理学研究的良好模型动物[5]。但其在疾病模型的开发应用方面仍然非常有限，自发性疾病模型的开发尚为欠缺，资源的附加值还有很大的提升空间。因此，建立广东省内幼年期具体年龄段实验用食蟹猴的血液学指标参考值不仅对其应用提供重要的参考意义，且对食蟹猴日常疾病的诊断及动物模型的开发意义深远。本实验对幼年期具体年龄段正常食蟹猴的血液学指标测定，并进行性别间比较，为其在生物医学领域的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1～2周岁(1≤x<2)食蟹猴273只，雌性124只，雄性149只；2～3周岁(2≤x<3)食蟹猴307只，雌性244只，雄性63只；3～4周岁(3≤x<4)食蟹猴273只，雌性124只，雄性149只。所选食蟹猴均为正常未用于实验的动物。级别：普通级；动物提供单位：广东春盛生物科技发展有限公司[SCXK(粤)2014～0027]。饲养条件：于广东春盛生物科技发展有限公司内群居饲养[SYXK(粤)2015～0152]，环境温度：18℃～26℃，相对湿度40%～70%，照明：采用12 h/12 h昼夜明暗交替。已经通过广东省实验动物监测所IACUC的审查，编号为：IACUC 2018002。在满足实验动物3R原则的基础上为实验动物提供充足的动物福利。

1.2 主要试剂与仪器

血红细胞分析用稀释液(CELLPACK DFL)、Hb溶血剂(SULFOLYSER)、WNR溶血剂(Lysercell WNR)、WDF溶血剂(Lysercell WDF)、WDF染色液(Fluorocell WDF)、WNR染色液(Fluorocell WNR)、PLT荧光染色液(Fluorocell PLT)(批号分别为：A7010、A7014、A8006、A7019、A7062、A7047、A7094，日本SYSMEX(希森美康)株式会社)。血液分析仪XN-1000 V[B1]型(日本Sysmex株式会社)。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集

动物禁食12 h后，非麻醉状态下使用2 mL含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)真空采血管对实验动物采用前肢头静脉采血2 mL，保存样本并于1.5 h送检。

1.3.2 血液学指标测定

使用Sysmex XN～1000 V 全自动血液分析仪对动物抗凝血进行以下指标测定：白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞比积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数(PLT)、红细胞分布宽度-标准差(RDW-SD)、红细胞分布宽度-变异系数(RDW-CV)、血小板分布宽度(PDW)、平均血小板体积(MPV)、大血小板比率(P-LCR)、血小板比积(PCT)、中性粒细胞(NEUT#)、淋巴细胞(LYMPH#)、单核细胞(MONO#)、嗜酸性粒细胞(EO#)、嗜碱性粒细胞(BASO#)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、淋巴细胞百分比(LYMPH%)、单核细胞百分比(MONO%)、嗜酸性粒细胞百分比(EO%)、嗜碱性粒细胞百分比(BASO%)。

1.3.3 参考值范围建立

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 参考值范围的建立

2.2 1～2周岁(1≤x<2)食蟹猴血液学指标

雄性动物与雌性动物相比较，在红细胞方面，雌雄动物没有显著性差异(P>0.05)。免疫细胞中LYMPH、BASO、NEUT指标差异极显著(P<0.01)，其中雄性动物BASO和LYMPH显著低于雌性动物，而NEUT则雄性动物显著高于雌性动物(P<0.05)。血小板方面，PLT及P-LCR在雌雄动物间差异极显著(P<0.01)，PDW及MPV则在雌雄动物间差异显著(P<0.05)，除雄性动物PLT极显著高于雌性动物外(P<0.01)，P-LCR、PDW、MPV均显著低于雌性动物(P<0.05)。其余指标均没有显著性差异，详见表2。

2.3 2～3周岁(2≤x<3)食蟹猴血液学指标

2～3周岁雌雄食蟹猴血液学指标相比较，红细胞指标除RDW-SD雄性动物显著低于雌性动物外(P<0.05)，其余指标均没有显著性差异(P>0.05)。免疫细胞除BASO指标雄性动物极显著低于雌性动物外(P<0.01)，其余指标均无显著性差异。而血小板方面，雄性动物PDW、MPV及P-LCR极显著低于雌性动物(P<0.01)，其余各指标均无显著性差异，详见表3。

表1 幼年期食蟹猴血液学指标参考范围

注：1～2周岁(1≤x<2)、2～3周岁(2 ≤x<3)、3～4周岁(3 ≤x<4)食蟹猴数量分别为273、307、273只。

Note. The number of cynomolgus monkeys aged 1-2 (1≤x<2), 2-3 (2≤x<3) and 3-4 (3≤x<4) years were 273, 307 and 273, respectively.

表2 1～2周岁(1≤x<2)食蟹猴血液学指标

注：雄性动物149只，雌性动物124只；与雄性动物相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Number of male monkeys is 149 and female monkeys is 124. Compared with the males，*P<0.05，**P<0.01.

表3 2～3周岁(2≤x<3)食蟹猴血液学指标

注：雄性动物63只，雌性动物244只；与雄性动物相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Number of male monkey is 63 and female monkey is 244. Compared with male,*P<0.05，**P<0.01.

表4 3～4周岁(3≤x<4)食蟹猴血液学指标

注：雄性动物149只，雌性动物124只；与雄性动物相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Number of the male monkeys is 149 and female monkeys is 124. Compared with the males,*P<0.05，**P<0.01.

2.4 3～4周岁(3≤x<4)食蟹猴血液学指标

雌雄动物相比较，红细胞方面，雄性食蟹猴RBC显著高于雌性，而MCV、RDW-SD则显著低于雌性食蟹猴(P<0.05),其余各指标均无显著性差异(P>0.05)；在免疫细胞方面，WBC差异显著(P<0.05)，而LYMPH、NEUT和EO差异极显著(P<0.01)，除NEUT雄性动物极显著低于雌性动物外，雄性动物WBC、LYMPH、EO显著高于雌性动物(P<0.05)，其余各指标无统计学意义。血小板方面，雄性动物PLT显著高于雌性动物，而PDW显著低于雄性动物(P<0.05)，雄性动物MPV、P-LCR则极显著低于雌性动物(P<0.01)，其余各指标无显著性差异，详见表4。

2.5 各年龄段血液学变化趋势

免疫细胞计数方面，动物随年龄的增长，其WBC、BASO呈下降趋势；雌雄动物LYMPH指标在1～3周岁缓慢下降，而雄性动物则在3～4周岁呈上升趋势；雌雄动物NEUT在1～4周岁呈上升趋势，而雄性动物在1～3周岁上升，在3～4周岁下降，如图1所示。

血小板指数方面，MPV、PDW、P-LCR指标雌性动物高于雄性动物且在随年龄的增长而下降；相反，雄性动物PLT远高于雌性动物，且两者均在1～2周岁缓慢减少而在3～4周岁时增加，如图2所示。

红细胞方面，雌性动物和雄性动物RBC、HCT、HGB指标在其两岁以下均呈下降趋势，而在3～4岁时增加且雄性高于雌性；雌性动物MCV、MCH在1～4周岁年龄段高于雄性动物，且均在1～2周岁呈上升趋势，在3～4周岁呈下降趋势，见图3。

图1 免疫细胞计数各年龄段变化趋势Figure 1 Trends of immune cell counts in different age groups

图2 血小板计数及血小板指数各年龄段变化趋势Figure 2 Trends of platelet counts and platelet indexes in different age groups

图3 红细胞计数及红细胞指数各年龄段变化趋势Figure 3 Trends of erythrocyte counts and erythrocyte indexes in different ages

3 讨论

药物的药效学研究、非临床安全性评价研究及临床前安全性评价研究是新药研发的核心内容。非人灵长类实验动物是药物新陈代谢研究的良好载体，在已研究的化合物中，71%证实药物在猴体内代谢和人体内代谢近似性好[10]，关于食蟹猴的血液学指标数据目前已有报道[11-14]，且本研究相关指标与文献报道存在差异。除了年龄和性别为主要影响因素外，动物个体年龄跨度较大，血液生理指标多受地域来源、环境、采集及储存方式、检测仪器等多方面因素的影响而存在差异[15]。

广东春盛生物科技发展有限公司食蟹猴存栏多达20 000余头，10多年来因广东从化优越的气候环境和地理条件而稳定繁育。根据兽医的日常观察与经验，1周岁的食蟹猴大致相当于人类的4周岁，本研究随机选用该公司幼年期不同年龄段正常实验用食蟹猴共853只进行血液学指标的测定与研究，大量的实验动物样本量为其血液学参考值范围的建立提供支撑，参考值范围见表1。

本研究实验结果表明：年龄差异及性别差异可能对食蟹猴血液学某些指标如RBC、HGB、WBC、LYMPH、PLT等存在影响。

红细胞方面，动物在3周岁前，雌性动物其红细胞数量如HGB、HCT、MCV、MCH等普遍高于雄性动物，而在3～4周岁的年龄段，雄性动物红细胞如RBC、HGB等明显升高并高于雌性动物，见图3。可能为幼年猴机体为满足气体交换，促进新陈代谢而表现的正常状况，而后期雄性动物红细胞升高则可能与机体生长发育有关，雄性激素分泌水平升高促进蛋白合成，从而利于红细胞生成；雄性食蟹猴RBC高于雌性，这也可能与雌性食蟹猴的月经生理周期相关，张晓钿等[16]、Schuurman等[17]及Kwon等[18]亦先后报道了此问题，且检测结果与本研究实验结果相似。与石巧娟等[7]结果相比较，其幼年期组(18～36月龄)红细胞以MCV、MCH偏低，其余指标基本一致。王崇圳等[19]报道的结果中，其MCV及MCH指标雄性动物高于雌性动物与本研究结果相反；与李伟等[20]结果比较，其4～6岁雌性群居食蟹猴RBC、HGB高于本研究结果，而其MCV及MCH偏低。可能为个体发育性成熟、环境气候、地理位置、动物数量及动物应激等因素所导致。与儿童的红细胞参数相比较[21]，其变化趋势基本一致。

免疫细胞方面，3周岁前动物的免疫细胞数量较多，在3～4周岁时多呈下降趋势且雄性动物WBC、LYMPH高于雌性动物，见图1。可能为年幼的食蟹猴因免疫系统、免疫器官尚未发育完善而高于其他年龄段；与相关已报道的文献相比较，大致年龄段3～4周岁的食蟹猴其WBC、LYMPH指标雄性高于雌性，与本研究结果相一致。与张晓钿等[16]、刘士刚等[14]、石巧娟等[12]结果相比较，WBC及LYMPH指标均为雄性动物高于雌性动物，而本研究实验结果相对偏高。可能与应激诱导条件有关，提示建立实验室生物数据时应考虑到不同区域、动物不同性别、不同年龄及年龄跨度的不同而存在的差异性。参考正常人类不同年龄外周循环白细胞计数，4～12周岁儿童免疫细胞随年龄的增长而下降，其变化伴随免疫系统发育成熟过程[21]，也可能为地域性差异所导致[6]，食蟹猴免疫细胞变化情况与人类相比较基本一致[21]。

血小板方面，血小板指数(MPV、PDW、P-LCR)呈下降趋势且雌性动物高于雄性动物，而PLT数量则雄性显著高于雌性且在3～4周岁时呈上升趋势，见图2。可能为幼年动物生长发育阶段，骨髓细胞增殖、分化为造血干细胞，血小板因巨核细胞的增多而呈调节性变化。与石巧娟等[12]、李岩等[13]研究结果相一致。与刘士刚等[14]结果相比，其3～5岁龄食蟹猴PLT指标偏低，其余指标基本一致。与李伟等[20]、田朝阳等[22]结果比较，其雌性动物PLT指标均偏低，且随年龄增加而呈下降趋势，可能为动物数量、地域因素、年龄跨度大因素导致。这也提示动物随年龄的增长其血小板计数有下降的趋势[23]。本研究结果也显示动物血小板指数随年龄增长有所下降，PLT雄性动物高于雌性，可能由于雄性动物活泼好动而致使PLT高于雌性动物[23]，亦可能雌性动物处于生理周期所引起。

因幼年动物处于生长发育阶段，而3～4周岁的食蟹猴恰好亦处于向性成熟阶段过渡，因此血液学各指标在该年龄段变化较大。本研究提供了较常用于实验的幼年期食蟹猴具体年龄段的背景数据，初步建立广东省内幼年期食蟹猴血液学指标参考值范围，为应用食蟹猴进行药物的药效学研究及非临床安全性评价研究等方面提供血液学指标的参考及支撑数据。