肥胖及限食对胰岛素分泌调节异常的影响

赵 田，汤雅迪，赵一楠，宗艾伦，史晓鹏，周迎生

(首都医科大学附属北京安贞医院内分泌代谢科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

肥胖导致胰岛β细胞功能紊乱，葡萄糖刺激下的胰岛素分泌障碍，是2型糖尿病的主要危险因素。胰岛β细胞异常表现的早期为胰岛素分泌第一时相下降或消失[1]。既往研究表明，饮食控制减轻体重可以遏制或延缓肥胖向2型糖尿病进展。通过限食可以有效降低体重，引起机体适应性代谢改变，从而降低2型糖尿病、高血压、心血管疾病和癌症的患病风险[2-3]。然而，正常体重下的限食对体重及β细胞胰岛素分泌功能的影响如何，是否会显著改变胰岛素分泌水平和胰岛素敏感性对预防糖尿病有重要临床意义。因此，本研究通过对C57BL/6小鼠进行高脂肥胖或限食减重干预，观察胰岛β细胞功能及形态学变化，提供研究依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]。在首都医科大学附属北京安贞医院实验动物科学部实验动物房完成饲养[SYXK(京) 2016-0027]，给予动物自由饮水，饲养环境温度22℃～25℃，相对空气湿度维持在45%～65%，12 h光照/黑暗交替环境。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：AEEI-2017-107)。随机分为对照(n=12)、高脂肥胖(n=12)和限食组(n=12)，分别给予普通(Research Diets D12450 J)、高脂饲料(Research Diets D12492)连续饲喂12周，限食组采用普通饲料(Research Diets D12450 J)进行饲喂，以正常对照组每日摄食量的60%[4]作为限食组小鼠每日喂食量。实验进程中，每日观察小鼠的一般状况，各组小鼠每周禁食12 h之后称量小鼠体重一次。每隔2周，各组小鼠禁食不禁水12 h之后，通过在鼠尾静脉采血，使用便携式血糖仪测定各组小鼠空腹血糖。

1.2 主要试剂与仪器

胶原酶Ⅺ及胎牛血清购于Sigma-Aldrich公司，RPMI 1640培养基、DMEM培养基购于Gibco公司，生物合成人胰岛素注射液诺和灵R购于诺和诺德中国制药有限公司，苏木素、伊红等购于北京中杉金桥公司，小鼠超敏胰岛素 ELISA 试剂盒 (Alpco 公司，型号80-INSMSU-E01)，血糖仪(Bayer公司，型号ContourTMTS)，体视显微镜(重庆重光仪器公司，型号SD111)，二氧化碳培养箱(上海善治仪器设备有限公司，型号HH. CT-P型)全自动组织脱水机(Leica公司，型号TP1020)，石蜡包埋机(Leica公司，型号EG1150 H)，石蜡切片机(Leica公司，型号RM2235)。

1.3 实验方法

1.3.1 腹腔葡萄糖耐量试验(intra-peritoneal glucose tolerance test, IPGTT)

饲养10周后行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)[5]。小鼠禁食过夜16 h，给予腹腔注射25%葡萄糖 (2 g/kg)，鼠尾采血，血糖仪测定0 min及糖负荷后15 min、30 min、60 min、120 min的血糖，同时用微量采血吸管(北京红星双北医疗器材公司)鼠尾采血50 μL，4℃ 3000 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存，ELISA法待测血浆胰岛素浓度，并计算以下指标：

(1)胰岛素生成指数：用于评估早时相胰岛素分泌，计算公式如下[6]：[15 min血浆胰岛素(μU/mL)-空腹血浆胰岛素] / [15 min血糖(mmol/L)-空腹血糖]。

(2)胰岛素曲线下面积(area under the curve, AUCi)：应用梯形面积法计算120 min胰岛素曲线下面积，用于评估第二时相胰岛素分泌。

1.3.2 胰岛素耐量实验(insulin tolerance test，ITT)

胰岛素耐量实验反映胰岛素敏感性。小鼠禁食不禁饮6 h，按体重腹腔注射人短效胰岛素(0.75 mU/g)，分别测定注射前、注射后 15 min、30 min、60 min 及 120 min 血糖水平，采用胰岛素注射后血糖除以基础血糖表示血糖变化程度，绘制血糖变化曲线，计算血糖曲线下面积(AUC)并进行统计分析。

1.3.3 小鼠胰岛的分离、纯化

小鼠禁食过夜，采用胶原酶消化分离胰岛，实验方法参照文献进行[1,7]，胰岛过夜培养以使胰岛功能恢复，并用于胰岛素分泌实验及胞浆胰岛素含量测定实验。倒置显微镜拍照，测量胰岛直径。

1.3.4 葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)

胰岛置于KRBH缓冲液(0.5%BSA)中在37℃ CO2培养箱中预孵育1 h，取大小匹配的胰岛移入24孔板，每孔10个，加入含2.8 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖的KRBH刺激液，每孔2 mL，孵育1 h。收集上清液用于胰岛素释放测定，根据既往研究中的方法完成小鼠胰岛的胰岛素分泌实验[4]。高糖刺激的胰岛素分泌/基础胰岛素分泌即为刺激指数(stimulation index, SI)，它常用于评估胰岛对葡萄糖的反应能力。

1.3.5 胰岛素浓度测定

采用小鼠超敏胰岛素试剂盒测定。从-80℃冰箱中取出样本，放置至室温，涡旋混匀 5 s，按照既往研究中方法测定胰岛素浓度[8]。

1.3.6 标本采集

小鼠禁食过夜12 h，1%戊巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射麻醉，测量体重、体长(鼻尖至肛门外沿的距离)、腹围，计算Lee’s指数[9]，Lee’s指数=体重(g)1/3/体长(cm)×1000。完整剪取双侧附睾脂肪、双侧肾周脂肪及重要器官组织，迅速称量湿重。

1.3.7 胰腺HE染色

胰腺组织脱水后石蜡包埋(EG1150 H，Leica公司，德国)，切片厚度6 μm，室温下30%乙醇中展片时间 2～3 min后，80℃烤箱内烤100 min，以防止组织后续染色中脱落。石蜡切片脱蜡，经苏木素、伊红染色，胶封片观察。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠体重及能量摄入变化

8周龄小鼠在喂养1周时，高脂肥胖组体重超过限食组，差异有统计学意义(25.9±0.6)gvs(22.8±0.8)g， (P=0.019)，2周后则高于正常对照组，差异有统计学意义(28.3±0.7)gvs(23.9±0.4)g，(P<0.001)。限食组小鼠在限食2周后，体重低于正常对照组(21.4±0.6)gvs(23.9±0.4)g，(P=0.015)，见图1A。限食组小鼠的摄入食物能量是正常对照组的60%，根据对照组能量摄入调整限食组热量。经过12周的高脂喂养，高脂肥胖组小鼠的能量摄入量较对照组增加了22.9% (70.6±1.2) kJ/(天·只)vs(54.4±1.4) kJ/(天·只)，(P<0.001)(见图1B)。

注：A. 小鼠体重变化；B.小鼠能量摄入变化。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001；与高脂肥胖组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。图1 饮食影响小鼠体重及能量摄入变化Note. A, Body weight changes in the mice. B, Energy intake changes in the mice. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 1 Body weight and energy intake changes in the mice

2.2 高脂及限食对小鼠体重及脂肪量的影响

实验终点时，高脂肥胖组小鼠的体重比对照组体重增加了55.7%(P<0.001)，比限食组小鼠体重增加了79%(P<0.001)，高脂喂养小鼠表现为显著腹型肥胖、腹围明显增加，体内胰腺、肝及脂肪组织(肾周、附睾旁)均显著增加(P<0.05)。相反，限食组小鼠的体重、腹围以及肝、肾周脂肪重量均显著低于正常对照组(P<0.05)，但胰腺、附睾脂肪重量等与对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。高脂肥胖组空腹胰岛素是对照组的3.6倍(P<0.001)。见表1。

表1 实验终点时小鼠的代谢参数

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与高脂肥胖组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with high-fat obesity group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.

2.3 高脂及限食对胰岛素敏感性的影响

经过8周饲养，采用胰岛素耐量实验评估高脂及限食对胰岛素的敏感性。高脂小鼠对胰岛素的敏感性降低，血糖下降的比例低于对照组和限食组，胰岛素耐量血糖下面积大于对照组和限食组。限食组相比于对照组无明显差异，在120 min时血糖低于对照组(3.0±0.3) mmol/Lvs(4.2±0.4) mmol/L(P<0.05)，胰岛素注射后血糖与基础血糖的比值在各时间段均无明显统计学差异，见图2。

注A、B： ITT血糖及血糖曲线下面积的比较。C、D：血糖/基础血糖(%)及曲线下面积的比较。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001；与高脂肥胖组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。图2 高脂及限食对胰岛素敏感性的影响。Note. A, B，The ITT blood glucose levels and the area under the blood glucose curve in the control, high-fat obesity, and calorie restriction groups. C, D， Ratio (%) of blood glucose to basal glucose concentrations in ITT (C) and the area under the curve (D) among groups. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 2 Effects of high fat and calorie restriction on insulin sensitivity

2.4 高脂及限食对小鼠糖耐量、早时相及第二时相胰岛素分泌影响

采用IPGTT实验评估高脂及限食对胰腺β细胞分泌胰岛素功能的影响。高脂肥胖组小鼠的空腹血糖及血糖曲线下面积比对照组分别增加44.6%(P<0.01)、45.4%(P<0.001)，胰岛素曲线下面积增加了1.2倍(P<0.001)，比限食组增加了1.7倍。而限食组小鼠各时间点的血浆胰岛素水平和早相胰岛素分泌与正常对照组的差别无统计学意义(P>0.05)，但血糖曲线下面积相比于对照组降低了70.8% (P<0.05)，见图3。

注：A、B： IPGTT实验中血糖水平及血糖曲线下面积。C、D： IPGTT实验中胰岛素水平及胰岛素曲线下面积。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与高脂肥胖组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。图3 高脂及限食对糖耐量、早时相和第二时相胰岛素分泌的影响(n=8)Note. A, B， The IPGTT blood glucose levels and the area under the blood glucose curve among groups. C, D， The IPGTT blood plasma insulin levels and the area under the plasma insulin curve among groups. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 3 Effects of high fat and calorie restriction on glucose tolerance, early phase and second phase insulin secretion

2.5 高脂及限食对胰岛形态的影响

实验终点胰腺组织HE染色显示如图4A所示。高脂肥胖组的小鼠染色结果显示胰岛体积明显肥大，同一视野下胰岛及其内分泌细胞数量明显增加。限食组小鼠染色结果显示胰岛形态规则完整，结构清晰，同一视野下胰岛及其内分泌细胞数量明显减少。研究终点体外分离胰岛，定量分析测量胰岛直径，结果如图4B所示，高脂肥胖组胰岛直径比正常对照组增加了9.5% (173.6±15.2)μmvs(158.2±13.5)μm，(P<0.001),比限食组增加了 21.2% (173.6±15.2)μmvs(143.2±8.6)μm，(P<0.001)。限食组小鼠的胰岛直径最小，比正常对照组减少了10.1%(P<0.05)。

注：A：三组小鼠胰腺切片的代表性HE染色图像(×400)。B：三组小鼠胰岛分离结果，每组测量4只小鼠的胰岛。图4 高脂及限食对胰岛形态的影响。Note. A, Representative HE-stained images of pancreatic tissue (×400). B, Results of islet isolation in three groups of mice. The islets of 4 mice were measured in each group.Figure 4 Effect of high fat and calorie restriction on islet morphology

2.6 离体胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)

高脂肥胖组的基础胰岛素分泌比对照组增加了23.5%(P<0.05)，比限食组增加了61.5%(P<0.01)，而高糖刺激的胰岛素分泌降低了25.3%(P<0.05)，比限食组降低了28.1%(P<0.001)，提示高脂肥胖组小鼠胰岛表现为葡萄糖刺激时胰岛素分泌降低。限食组小鼠高糖刺激的胰岛素分泌与对照组相比无无统计学意义的差别(P>0.05)，见图5 A。限食组的刺激指数最高，比正常对照组增加了34.8% (P=0.012)，比高脂肥胖组增加了1.2倍(P<0.001)，见图5B。

注：A： 离体胰岛在2.8 mmol/L葡萄糖和16.7 mmol/L葡萄糖刺激下的胰岛素分泌。B： 胰岛的刺激指数。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001；与高脂肥胖组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。图5 高脂及限食对离体小鼠胰岛GSIS的影响(n=5)Note. A, Glucose-stimulated insulin secretion was measured in isolated islets at 2.8 and 16.7 mmol/L glucose. B, The stimulation index calculated by dividing insulin secretion in response to 16.7 mmol/L glucose by that in response to 2.8 mmol/L glucose. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 5 Effect of high fat and calorie restriction on glucose-stimulated insulin secretion in isolated islets

3 讨论

本研究中高脂肥胖组小鼠经过12周喂养出现显著肥胖，腹围、Lee指数、脏器(附睾脂肪、肝、胰腺)重量增加，糖耐量受损和胰岛素抵抗加重，伴有胰岛代偿性肥大，与既往文献报道一致[10-13]。胰岛β细胞是生成和释放胰岛素的部位。离体胰岛实验显示高脂肥胖组胰岛素含量增加，但存在胰岛素分泌缺陷，即在2.8 mmol/L葡萄糖刺激时基础胰岛素分泌增加而16.7 mmol/L葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低，提示高脂肥胖组小鼠的β细胞功能紊乱并非由于胰岛素储备不足，而是由于缺陷性的分泌。肥胖可引起外周胰岛素抵抗，会导致胰岛β细胞的功能紊乱，表现为胰岛素分泌双时相正常，而胰岛素分泌水平增加。在葡萄糖钳夹试验中，胰岛素分泌表现为第一时相和第二时相分泌；在血糖升高数分钟内，胰岛素分泌急剧增加后快速下降，形成第一时相；随之出现胰岛素缓慢增加，持续至血糖下降到基线水平，形成第二时相[14]。本研究中高脂肥胖组早时相胰岛素分泌趋向降低，但第二时相胰岛素分泌显著升高。这种现象常见于糖耐量减低及早期的T2DM患者，随着病情进展，到了T2DM后期第二分泌相也较低平[15]。在胰岛β细胞仅有分泌功能障碍，而未出现显著的组织学改变之前，早期干预，胰岛功能受损是可逆的[16]。

饮食控制能量摄入可以有效减低体重，长期摄入足够营养素的限食会引起适应性代谢改变[2-3]。对C57BL/6J小鼠进行正常饮食和禁食各24 h交替的间断禁食12周，胰岛素敏感性增加，糖耐量改善[17]。限食已被证明可以延长啮齿动物和灵长类动物的健康状况和寿命[18]。限食对于小鼠胰岛β细胞的功能影响尚无具体研究。本课题组对C57BL/6小鼠进行限食研究其胰岛功能改变。小鼠经40%的限食后，胰岛面积比对照组变小，胞浆胰岛素含量降低，但葡萄糖刺激的胰岛素分泌仍正常，提示正常限食后胰岛素储备而非胰岛素分泌减少。限食组小鼠糖负荷后血糖降低，而血浆胰岛素水平正常，这一结果与既往研究一致[19-20]。限食减轻体质量、改善血糖水平的原因可能是长期供能不足，限食组小鼠的胰岛素敏感性升高，糖负荷后可以快速利用葡萄糖。

在动物研究中，减少大鼠和小鼠热量摄入20%～50%，可将其中位和最大生存时间延长50%，并可预防或延迟多种慢性疾病如肥胖、2型糖尿病、肾病、心肌病的发病[21]。Gao等[4]发现经过3周40%的限食干预，高脂饮食转为限食组的小鼠体重降至正常，并且糖耐量、胰岛素敏感性、胰岛素分泌和胞浆胰岛素含量均完全恢复正常。而高脂饮食转为普通饮食3周后小鼠的糖耐量恢复正常，体重有所降低但未恢复正常，早时相胰岛素分泌及离体胰岛的高糖刺激的胰岛素分泌较高脂肥胖组并无改善[4]。

高脂饮食增加小鼠体质量，出现糖耐量受损和胰岛素抵抗，胰岛代偿性肥大伴随胰岛素分泌缺陷，而中度的限食能明显降低小鼠体质量和血糖，不影响胰岛素分泌反应，但空腹血胰岛素水平降低。本研究已经发现高脂肥胖对胰岛素分泌的损伤作用，但其损伤机制的分子生物学研究，尚需进一步实验探讨。