禁食时间对昆明小鼠糖耐受和胰岛素分泌的影响

汤 琦，施 磊，郑 璐，代琴芳，陈小川

(西南大学动物科技学院，重庆 400715)

口服葡萄糖耐受实验(oral glucose tolerance test,OGTT)是目前评价机体糖代谢状态的标准之一，同时也是评价机体胰岛β细胞功能的常用方法[1]。为了使胃充分排空，其中比较关键的一步是禁食，但过长或过短时间禁食对机体存在潜在的影响，使得实验动物的生理状态出现差别[2-3]。实验动物禁食时间过长会产生强烈的饥饿感，影响正常的糖代谢，胰岛素敏感性下降，出现胰岛素抵抗，在OGTT中更容易出现高血糖现象[4]；禁食时间过短，胃内容物对实验结果产生一定影响。因此，值得进一步研究和探讨实验动物在OGTT中最佳禁食时间。大鼠的糖耐受实验禁食时间有较系统的研究，为10～12 h，在小鼠的诸多糖耐量实验中，禁食时间并不统一。有人选择4、6、8 h作为禁食[5]，但大部分普遍选择10～12 h为禁食时间[6-10]，最长禁食时间也有14～16 h[11-12]；国外对雄性C57BL/6J小鼠有较系统的研究，选择禁食0、3、6、24 h，在OGTT中禁食6 h是评估糖耐受的最佳方法[13]。但6～24 h之间跨度较大，实验结果差异大、分辨率不高，实验条件也不统一，没有很强的说服力。所以有必要在小鼠的品种、性别、年龄、体重、胰岛素抵抗、实验环境等多种影响因素同一的条件下对小鼠OGTT进行系统、详细的研究，可以更好地优化OGTT禁食方案。

小鼠具有各种不同基因背景的近交品系、突变品系和封闭群，为研究提供了多种动物模型选择。已有许多文献表明不同基因背景小鼠的糖代谢、脂代谢能力都有明显差异[14-16]，因此选择合适的品系作为研究对象就显得十分重要。糖尿病模型大部分是采用 C57BL/6J小鼠[17]，但现有的糖尿病模型新进展显示，C57BL/6J品系小鼠可能并不是糖尿病模型的理想动物[18]，该品系小鼠对实验环境要求较高，成模率、死亡率和昆明小鼠基本一致[19]，因此昆明小鼠是较C57BL/6J小鼠更为经济有效的建立糖尿病模型的小鼠品系[19]。C57BL/6J小鼠在OGTT中的禁食时间国外有较为系统的研究，但昆明小鼠没有比较系统的研究。昆明小鼠是我国生产量、使用量最大的远交群小鼠，它在我国生物医学动物实验中约为小鼠总用量的70%[20]。因此，研究人员参考了国外C57小鼠的案例，在昆明鼠上进行进一步研究和探讨。

一些研究表明，性别差异会影响体重、葡萄糖耐受、空腹血糖和胰岛素水平[21- 22]，40日龄雄性昆明小鼠的血糖和胰岛素水平上升更为显著，生化结果稳定可靠[23-24]。因此，本实验采用四组6～7周龄的雄性昆明小鼠，通过分别禁食4、8、10、12 h，利用OGTT比较每组昆明小鼠血糖浓度、胰岛素浓度、空腹血糖浓度值与胰岛素浓度值比值的差异，分析不同禁食时间后昆明小鼠血糖浓度和胰岛素浓度的变化。初步探讨禁食时间对昆明小鼠糖耐量和葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响，探寻比较合理的禁食时间。为昆明小鼠进行OGTT时提供科学的禁食时间的参考，也可在采用昆明小鼠建立糖尿病模型时，糖耐量实验的禁食时间提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

5～6周龄清洁级昆明雄性小鼠16只，体重31～34 g，由重庆市中药研究所提供[SCXK(渝) 2012-0006]，饲养在国家级动物科学实验教学示范中心[SYXK(渝) 2012- 0003]。小鼠每四只饲养于笼中(30 cm × 15 cm × 20 cm)，适应性饲养2周，饲以标准鼠料(重庆市中药所，重庆)，自由进食和饮水。室内温度为(28 ± 1)℃，光照16 L∶8 D，湿度为40% ～ 60%。实验当天小鼠随机分为 4 组，每组4只，然后分别禁食4、8、10、12 h，禁食时去除笼中的垫料和鼠料，只留充足的饮水。动物使用的伦理审批号(IACUC)为No. [2007] 3，实验过程按照实验动物的使用3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

葡萄糖(上海生工生物工程公司)，血糖试纸(美国Roche公司)，超敏小鼠胰岛素酶免试剂盒(易致生物科技有限公司)，血糖仪(罗氏，美国)，冷冻离心机(Eppendorf AG，德国)，酶标仪(Bio-Rad，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠口服葡萄糖耐量实验

禁食后，称取小鼠体重，然后将小鼠固定于固定器上，再断尾处理(约2 mm)。弃去两滴血后，采用血糖仪检测血糖浓度；紧接着使用抗凝血枪头(肝素钠处理)的移液枪尾尖采血70 ～ 100 μL。将上述采集的血样用离心机在4℃、3000 r/min条件下离心20 min，然后将血浆移至另一灭菌离心管中，放置冷冻盒上，以备随后胰岛素检测。之后葡萄糖按1.5 mg/g灌胃(8号灌胃针)，每只小鼠应当灌胃的葡萄糖体积(μL)=10 × 小鼠体重(g)，灌胃后立即记为0 min。随后的15、30、60、90 min测血糖浓度并尾尖采血。

1.3.2 小鼠血浆胰岛素浓度测定

将上述采集的血样用超敏小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒检测胰岛素浓度。先用标准品稀释液稀释倍比标准品，接着加样、封板、37℃温育30 min；随后配洗涤液，洗板后加酶标试剂，37℃温育30 min；然后洗板后加入显色剂，37℃避光显色15 min；最后加入终止液，在15 min内使用酶标仪450 nm波长读出OD值。试剂盒批间和批内检测精密度变异系数均小于10%。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠体重

禁食完成后，称量昆明小鼠体重，总体平均体重在(33.97 ± 2.61)g之间，各组小鼠体重没有差异，见表1。

2.2 不同禁食时间对小鼠血糖的影响

小鼠禁食后，随着禁食时间的延长，各组小鼠空腹血糖值逐渐降低，禁食8、10、12 h组小鼠空腹血糖分别低于禁食4 h组小鼠空腹血糖40%、56%、79%(P< 0.01)(图1A)。葡萄糖灌胃后，每组小鼠血糖立即升高，15 min时禁食4 h小鼠血糖比禁食10 h小鼠高5%，比禁食8、12 h小鼠血糖均高23%。30 min时各组小鼠血糖值均达到最高点，禁食12 h小鼠血糖低于其他三组15%左右；与0 min相比，30 min时禁食4、8、10、12 h小鼠血糖升高61%、73%、75%、74%，禁食10 h血糖上升幅度最大。30 min后血糖逐渐下降，90 min时各组小鼠血糖值均恢复到初始水平，各组小鼠血糖无差异(图1B)。通过曲线下面积分析，禁食10 h小鼠血糖曲线下面积最大，比禁食4 h小鼠血糖曲线下面积高31%(P< 0.05)，比禁食8、12 h小鼠分别高16%、17%(图1 C)。

2.3 不同禁食时间对小鼠胰岛素的影响

随着禁食时间的延长，各组小鼠空腹胰岛素都逐渐降低，禁食4 h的空腹胰岛素比禁食8 h高4%，大约是禁食12 h空腹胰岛素的两倍(图2A)。在灌胃之后，小鼠胰岛素含量立即升高，在15 min采血点上其含量最高，禁食4 h组的15 min胰岛素比0 min胰岛素高66%，比禁食8、10、12 h小鼠分别高60%、67%、71%。随后胰岛素下降迅速，大约在60 min降至基准值，禁食10 h小鼠下降幅度最大，比15 min最高点下降了65%；禁食12 h小鼠下降幅度最小，为46%(图2B)。禁食4 h组的胰岛素曲线下面积比其他三组分别高30%、34%、31%(图2C)。

2.4 不同禁食时间的空腹血糖与胰岛素比值

空腹血糖与血浆胰岛素的比值可作为最简便的胰岛素抵抗指标[25]。通过空腹血糖与血浆胰岛素的比值分析，昆明小鼠在OGTT前禁食4、8、10、12 h，没有改变胰岛素抵抗，总体平均值无显著差异。(图3)。

表1 小鼠体重变化

图1 不同禁食时间对小鼠血糖的影响Figure 1 Effects of different fasting time on blood glucose in the mice

图2 不同禁食时间对小鼠胰岛素的影响Figure 2 Effects of different fasting time on the insulin in mice

图3 不同禁食时间的空腹血糖与胰岛素比值Figure 3 Fasting blood glucose and insulin ratio with different fasting time

3 讨论

糖耐受实验已成为检测血糖耐受和胰岛素分泌最广泛应用的生理测试之一，实验前禁食时间的长短会对实验结果产生一定影响；小鼠作为糖耐受实验的研究对象，其品种、性别、年龄、体重、禁食时间等诸多因素的不同一，得到的实验结果可能会有一定差异。本实验在同一实验条件下，针对禁食时间研究发现，昆明小鼠在OGTT中禁食8～10 h是比较合理的禁食范围，糖耐受血糖变化差异大，胰岛素分泌较好，为昆明小鼠进行OGTT时提供科学的禁食时间的参考。

大量的研究表明外周组织会使胰岛素敏感性下降，使外周摄取葡萄糖降低，导致胰岛素抵抗[26]。在本实验中，昆明小鼠的体重为(33.97 ± 2.61)g，符合同年龄段昆明小鼠正常体重(35.26 ± 2.80)g[27]。禁食4、8、10、12 h后，小鼠各组空腹血糖值与空腹胰岛素值的比值无显著差异，总体平均值无显著差异，说明禁食后没有改变昆明小鼠胰岛素敏感性，所有小鼠胰岛素敏感性都保持一致。因此，本实验在同一的条件下，只针对禁食时间对昆明小鼠糖耐受的影响进行研究。

禁食会降低体内糖原和乳酸含量[25]，对糖代谢产生影响。不同禁食时间对小鼠的空腹血糖调节会产生一定影响[13]，禁食8、10、12 h小鼠空腹血糖浓度分别低于禁食4 h小鼠空腹血糖浓度40%、56%、79%，与前人研究结果一致[28]。禁食时间过长会使小鼠可利用能量减少[25]，导致血糖浓度降低。随着禁食时间的延长，小鼠血糖浓度下降缓慢，各个禁食时间段的空腹血糖浓度都有一定的浮动，血糖的这种变化主要与小鼠的禁食时间长短有关，不同的血糖变化趋势可能表明不同禁食时间对昆明小鼠胰岛素的敏感性不同。葡萄糖灌胃后，各组小鼠血糖均升高，30 min时各组小鼠血糖值均达到最高点。与0 min相比，禁食10 h血糖上升75%，上升幅度最大，血糖分辨率高。通过分析血糖曲线下面积发现，禁食10 h组的血糖曲线下面积最大。

在禁食状态下血液中胰岛素含量维持在基准水平[29]，禁食8 h小鼠的空腹胰岛素浓度比禁食4 h组小鼠低4%，而比禁食10 h组小高40%，大约是禁食12 h空腹胰岛素浓度的两倍。葡萄糖灌胃之后，小鼠胰岛素含量立即升高，禁食8 h胰岛素浓度上升幅度最小，其他三个禁食组胰岛素浓度上升幅度基本一致，昆明小鼠禁食8 h，糖耐量胰岛素处于较低水平。从胰岛素曲线下面积看，禁食8、10、12 h小鼠胰岛素曲线下面积基本一致，比禁食4 h小鼠分别低30%、34%、31%，禁食8 h小鼠的胰岛素曲线下面积最小。在整个糖耐受中，禁食8 h小鼠的胰岛素浓度和禁食4 h小鼠的胰岛素浓度较为一致，但禁食8 h小鼠胰岛素浓度曲线下面积低于禁食4 h小鼠。由此来看，禁食8 h左右小鼠胰岛素分泌量较少，对血糖调节效率高。

综上所述，本实验在同一条件下，对四组昆明小鼠分别进行4、8、10、12 h的禁食，通过OGTT分析血糖浓度、胰岛素浓度、空腹血糖值与空腹胰岛素值的比值发现，禁食8～10 h的昆明小鼠，葡萄糖刺激后，血糖变化趋势较好，分辨率高，胰岛素分泌量较好，在OGTT中可作为比较合理、有效、可靠的禁食时间。