响应面法优化叠鞘石斛多糖超声提取工艺

牟兰 田孟良 刘建桥 赵中莹 杨小倩 黄雪丽 刘帆

(四川农业大学农学院，成都 611130)

叠鞘石斛(Dendrobium anrantiacumRchb.var.denneanum(Kerr.)Z.H.Tsi)，多年生草本，兰科，线叶石斛变种[1]，又名，迭鞘石斛。药材为兰科植物叠鞘石斛的新鲜或干燥茎[2]。清代《植物名实图考》记载其为：“金兰即石斛之一种，花如兰而瓣肥短，色金黄有光灼”[3-5]。性味甘，微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热的功效，用于阴伤津亏，口干烦渴，病后虚热等证[2]。主要分布于四川，云南、贵州、台湾等地亦有少量分布[5-6]，叠鞘石斛对生态环境要求十分苛刻，因其种子细小，仅具有未分化的原胚，不含可供萌发与生长的营养成分，因此石斛的繁殖率低，生长速度缓慢，自然更新能力差[7]，从而导致了优质的野生叠鞘石斛数量极为稀少。

叠鞘石斛化学成分主要有多糖、联苄类、倍半萜、香豆素和甾体等，其中多糖为主要成分[8-9]。石斛多糖是结构复杂的生物大分子。Luo等[10]从叠鞘石斛中分离的多糖DDP的结构解析为：分子质量484.7kDa，单糖组成，n(Arab):n(Xyl):n(Man):n(Glc):n(Gal)为1.0:2.66:8.92:34.2:10.16。叠鞘石斛多糖具有多种生物活性。如在抗菌性方面，叠鞘石斛多糖水体物对小肠结肠炎耶尔森菌具有较强的抗菌作用，其抗菌机制可能涉及影响小肠结肠炎耶尔森菌的细胞膜通透性和核酸合成[11]；在抗肿瘤方面，罗傲雪[12]研究了叠鞘石斛多糖对人肝癌细胞和人正常肝脏细胞的药物抑制作用。结果显示，160μg/mL叠鞘石斛多糖作用48h能显著抑制人肝癌细胞SMMC-721的生长，且相同条件下对正常人肝脏细胞HL-7702的影响较小。表明叠鞘石斛多糖可能是一种毒副作用较小的抗肿瘤药物。并且，以S180肉瘤模型小鼠为研究对象，叠鞘石斛多糖在高、中、低3个浓度组抑瘤效果均较好(P＜0.05)，其中0.625mg/mL为其体内最佳抑瘤浓度；在抗氧化能力方面，叠鞘石斛多糖能显著增强荷瘤小鼠血清中SOD活力，降低MDA含量[12]。薛倩倩等[13]研究也表明，叠鞘石斛多糖对DPPH自由基、羟基自由基具有较好的清除率，对Fe2+也具有很好的螫合率，对脂质过氧化有明显的抑制作用；在增强机体免疫力方面，范益军等[14]研究得出，不同浓度的叠鞘石斛多糖表现出不同的免疫活性，其中多糖低浓度组(1.25mg/mL)有较高的肿瘤抑制率和免疫指数(P＜0.01)，并促进和调节IL-2、IFN-γ、TNF-α在机体内分泌(P＜0.01)，协调改善机体免疫系统功能。在降血糖方面，罗傲霜等[15]研究结果表明，迭鞘石斛多糖能显著降低四氧嘧啶高血糖小鼠空腹血糖，增强四氧嘧啶高血糖大鼠的糖耐量，而对正常小鼠空腹血糖和正常大鼠糖耐量没有明显影响。综上所述，叠鞘石斛多糖具有多种重要的生物活性，有着极高的药用价值[16-19]。

石斛多糖的提取方法包括水取法[20]、酶提法[21]、超声辅助法[22]、微波辅助法[23]、超高压辅助法[24]和湿法超微粉碎辅助法[25]等。超声辅助法是利用超声空化现象，使细胞渗透效应与毛细管效应增强，有效成分得以释放后与溶剂充分混合。该方法不仅可缩短提取时间，提高提取率，还可以避免高温对有效成分的影响[26]。而响应面法具有优化时间短，应用可信度高，求得的回归方程精度高，能够快速准确地确定多因素系统的最佳条件，并且兼顾试验随机误差等诸多优点[27-28]，有利于叠鞘石斛多糖提取工艺优化。目前，利用超声波辅助和响应面法优化叠鞘石斛多糖提取工艺尚未见报道。为了探索叠鞘石斛多糖最佳的提取条件，更好地提高珍稀原材料的利用率，本实验以3年生叠鞘石斛为研究对象，在单因素实验的基础上，选用Box-Behnken响应面法对叠鞘石斛多糖超声提取工艺[29]进行优化，为叠鞘石斛资源的深层次开发利用提供了理论参考及实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象

3年生叠鞘石斛新鲜植株(采自四川省雅安市石棉县，经四川农业大学农学院田孟良教授鉴定为叠鞘石斛)。

1.1.2 试验药品

无水苯酚、无水葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、正丁醇、三氯甲烷，丙酮均为分析纯试剂。

1.1.3 试验器材

LX-03型粉碎机；滚筒杀青机；JD500-3型电子天平；KQ-4001KDE型高功率数控超声波清洗器；DHG-9140A型干燥箱；旋转蒸发仪RE-52 AA；UV-1800分光光度仪；Thermo高速离心机等。

1.1.4 数据处理使用

Microsoft Excel 2016、DPS数据处理系统、Design-Expert.8.05b等软件进行数据分析处理。

1.2 方法

1.2.1 叠鞘石斛材料处理方法

随机抽取生长健壮、无病虫害的3年生新鲜叠鞘石斛茎段，去除其表面叶片和杂质，经蒸馏水清洗干净，吸水纸吸干，剪成1cm左右长的小段。于滚筒杀青机中快速杀青，再使用干燥箱80℃烘干至恒重。取出干燥好的叠鞘石斛，在粉碎机中粉粹并过20目筛，最后贮藏于4℃冰箱备用。

1.2.2 单因素试验设计

分别考察不同水平的超声功率(200、240、280、320、360和400W[30])；超声温度(30、40、50、60、70和80℃[31])、超声时间(15、20、25、30和35min[32])对叠鞘石斛多糖得率的影响。

1.2.3 叠鞘石斛粗多糖提取

精确称取叠鞘石斛粉样3.0g，按单因素实验设计分别超声提取3次，合并3次滤液，用旋转蒸发仪浓缩至一定体积。向浓缩液中缓慢加入无水乙醇，搅拌，至混合液乙醇浓度为 80%，4℃过夜、过滤、冷冻干燥得叠鞘石斛粗多糖。

1.2.4 叠鞘石斛精制

多糖的制备取石斛粗多糖，蒸馏水溶解。Sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷=1:4)萃取去除蛋白质，重复萃取至无沉淀生成。紫外-可见光扫描无明显蛋白质吸收峰说明蛋白质已经除净。用透析袋48h流水透析，蒸馏水透析24h，除去无机盐、小分子杂质及色素，将透析袋内多糖液醇沉，过滤得沉淀，无水乙醇、丙酮各洗2遍，真空冷冻干燥至恒重即为叠鞘石斛精多糖。

1.2.5 葡萄糖标准液配制

准确称取0.50g无水葡萄糖标准品，置于50mL的容量瓶中，加蒸馏水溶解、定容、摇匀，即为10mg/mL的葡萄糖母液，再准确吸取5mL于100mL量瓶中，用蒸馏水定容即得葡萄糖标准溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mL的葡萄糖标准溶液置于20mL具塞试管中，用蒸馏水定容至10mL，再往试管中加入5%的苯酚溶液1.0mL，然后快速加入98%浓硫酸5.0mL，静置10min，使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20min，于488nm处测吸光度值，以葡萄糖浓度(C)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。得线性回归方程为：y=7.7791x+0.1137(R2=0.9972)。

1.2.6 叠鞘石斛多糖含量的测定方法

采用苯酚-硫酸法[33]，对叠鞘石斛多糖进行测定。将叠鞘石斛精多糖1mg溶于1mL蒸馏水得样品溶液，取100μL样品溶液+200μL 5%苯酚溶液+1mL浓硫酸，在488nm处检测吸光度。参照寇莹莹等[34]的方法配制5%的苯酚溶液。

1.2.7 叠鞘石斛多糖提取率的计算

提取率(%)=测得多糖含量/叠鞘石斛粉质量(干重)×100%。

1.2.8 Box-Behnken响应面法分析

通过单因素试验，找到上述3个考察因素中多糖提取率最大值的条件，将最大值条件标记为“0”，位于最大值左右两边的条件分别记为“-1”和“1”，得到3因素3水平的响应面设计[35]，并进行由软件生成的响应面设计试验。同时，对试验数据进行回归分析，预测超声辅助提取叠鞘石斛多糖的最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 超声辅助单因素试验结果

2.1.1 超声功率对叠鞘石斛多糖的影响

叠鞘石斛多糖提取率与超声功率的关系的结果见图1。由图1可以看出，在200～320W范围内，叠鞘石斛多糖提取率随着超声功率提高而增高，在超声功率320W时多糖提取率达到最大值，此后再增大超声功率，多糖提取率开始下降。以320W为多糖超声功率中心试验点。

图1 超声功率对叠鞘石斛多糖提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction of polysaccharides from Dendrobium denneanum

2.1.2 超声温度对叠鞘石斛多糖提取率的影响

叠鞘石斛多糖含量与超声功率关系如图2所示。图2表明，超声过程中温度对叠鞘石斛多糖提取得率有较为明显的影响，在30～70℃范围内，温度升高多糖提取率增大，且在60～70℃时，多糖提取率增长最快。在超声温度为70℃时多糖提取率达到最大值，此后再增大，多糖提取率开始下降。因此选择70℃为多糖超声温度中心试验点。

图2 温度对叠鞘石斛多糖提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide extraction from Dendrobium denneanum

2.1.3 超声提取时间对叠鞘石斛多糖提取的影响

叠鞘石斛多糖提取率与提取时间的关系如图3所示。从图3可以看出，在超声时间15～25min范围内，叠鞘石斛多糖提取率随着超声时间延长而增加，超声时间至25min时多糖提取率达到最大值。此后再延长超声时间，多糖提取率有降低趋势。综合考虑，选择25min为多糖提取超声时间中心试验点。

图3 提取时间对叠鞘石斛多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction of polysaccharides from Dendrobium denneanum

2.2 Box-Behnken响应面法分析

2.2.1 模型建立

根据单因素试验结果，选择标准偏差值最大的3组实验因素作为下一步实验因素，选取了超声功率、温度、提取时间3个因素，采用3因素3水平的响应面分析法设计中心组合试验，将这3个因素中多糖提取率最大值条件标记为“0”，位于最大值左右两边的条件分别记为“-1”和“1”[35]，如表1所示。

使用Design-Expert.8.05b软件生成17个处理的试验，从而考察各因素之间相互作用以及对叠鞘石斛多糖提取率的影响，如表2所示。

2.2.2 回归模型的拟合方差分析

使用Design-Expert.8.05b对表2数据进行回归统计分析，得出二次回归统计分析表，如表3所示，在这里A：超声功率；B：温度；C：时间。最后，通过软件分析得到叠鞘石斛多糖提取率的回归方程如下：多糖含量=27.12-0.44×A+0.59×B-0.047×C-0.70×AB+1.03×AC-2.26×BC-2.62×A2-1.43×B2-1.53×C2。

表1 叠鞘石斛多糖响应面的因素水平设计Tab.1 Factor level design of response surface of polysaccharides from dendrobium denneanum

表2 响应面试验设计及结果Tab.2 Experimental design and results of response surface of polysaccharides

从表3的数据分析，回归模型P＜0.0001，达到了显著的水平，说明该二次回归模型是有意义的。此外，该回归模型R2=0.9851，说明拟合程度比较良好。拟失项P=0.1307，远远大于0.05，影响不显著。

2.2.3 响应面法优化叠鞘石斛多糖超声提取工艺条件

根据得出的回归方程对超声功率、温度、时间3个因素绘制响应面图(图4～6)，各图代表的是3个因素中的两个因素对叠鞘石斛多糖提取率的影响，能够体现出因素之间的交互作用，图中的底端黄色部分是等高线。由图4～6这3个响应曲面图可以看出各个因素对叠鞘石斛多糖提取率的影响，从图中分析得到温度对叠鞘石斛多糖提取率的影响最为显著，三者的主效应关系为：温度(B)＞超声功率(A)＞时间(C)，其中温度与时间的响应曲面最为陡峭，证明温度与时间的交互作用最为强。通过使用Design-Expert.8.05b软件对回归方程求解，得到叠鞘石斛多糖超声提取工艺条件为：超声功率320W，温度80℃，提取时间20min，理论多糖提取率为27.53%。经3次重复验证试验得到的多糖提取率平均值为27.05%，与理论值的误差仅为1.74%。

表3 响应面二次回归方程方差分析Tab.3 Variance analysis of two regression equation of response surface

图4 超声功率(A)与温度(B)对叠鞘石斛多糖提取率影响的响应曲面Fig.4 Response surface of ultrasonic power(A)and temperature(B)to the extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum

图5 超声功率(A)与时间(C)对叠鞘石斛多糖提取率影响的响应曲面Fig.5 Response surface of ultrasonic power(A)and time(C)to the extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum

图6 温度(B)与时间(C)对叠鞘石斛多糖提取率影响的响应曲面Fig.6 Response surface temperature(B)and time(C)to the extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum

2.2.4 4种不同提取工艺下叠鞘石斛多糖最佳得率的差异显著性分析

对最佳提取超声功率、最佳提取温度、最佳提取时间3个单因素条件下获得的叠鞘石斛多糖与最优响应面法获得的叠鞘石斛多糖得率进行显著性差异分析，得出最佳响应面法获得的叠鞘石斛多糖得率在P＜0.05水平与3个最佳单因素提取条件下的得率有显著性差异。在P＜0.01水平与最佳提取超声功率和最佳提取温度条件下获得的叠鞘石斛多糖差异显著(图7)。

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 叠鞘石斛多糖不同提取工艺的对比

叠鞘石斛多糖提取工艺主要分为传统的水浴回流法和超声提取法[36-37]，罗傲雪等[38]对叠鞘石斛多糖进行传统的水浴回流提取工艺进行优化，得到最优条件为：加水量300mL，回流3次，每次1.5h，多糖提取率为23.38%。与本试验相比较，结果说明本试验优化的超声工艺条件更佳，并且通过对比更加应证超声提取法操作更为简便，操作时间更短，更节能。

图7 不同最佳提取工艺条件下叠鞘石斛多糖得率Fig.7 The extraction rate of polysaccharides from Dendrobium denneanum under different optimum conditions

3.1.2 优化提取工艺的不同分析方法对比

经查阅文献，李旻[39]用乙醇回流提取叠鞘石斛多糖，苯酚-硫酸比色法测定在16.12%～17.51%之间，平均含量为16.84%。范益军等[40]使用正交分析法对叠鞘石斛多糖的超声提取工艺进行了优化。得到的最佳条件为：温度100℃、时间25min、pH=7，在此条件下叠鞘石斛多糖的平均提取得率为15.3%，而本试验的提取率为27.53%，结果说明响应面法比正交分析法获得的工艺条件更佳。张明会等[41]比较了响应面法与正交分析法设计提取天麻素，得出结论响应面法分析的提取率比正交分析法分析的提取率高出5.63%，黄菊等[42]比较了响应面法和正交分析法优化荞麦的芦丁，得出结论响应面法分析的提取率比正交分析法分析的提取率高出6.91%。因此，在响应面分析方法与正交分析法的对比中，响应面法得出的结果更优。

3.2 结论

本次试验使用了Box-Behnken响应面法优化叠鞘石斛多糖超声工艺提取的最优条件，即叠鞘石斛多糖超声提取工艺条件为：提取温度 80℃，提取时间20min，超声功率320W，理论多糖提取率为27.53%，经3次重复验证试验得到的多糖提取率平均值为27.05%，与理论值的误差仅为1.74%，证明此次试验使用响应面法优化得到的提取条件参数是准确可靠的，具有实际应用价值。叠鞘石斛多糖的超声提取法条件经过优化后，可以实现从叠鞘石斛原材料中提取更多的石斛多糖，从而节约了叠鞘石斛资源，对后续进一步研究叠鞘石斛多糖成分具有一定的指导意义，并对叠鞘石斛多糖提取的工业化有一定的应用价值。