胆碱膳食应激小鼠肠道菌群及代谢

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

肠道是人体最大的消化器官和微生态系统。研究表明：肠道内定居的菌群被认为是与宿主协同工作的一种类似免疫系统的细胞群体，能促进健康，但有时会引发疾病，具有遗传和环境因素的个体差异性[1]。而在环境因素中，膳食因素在调节肠道菌群组成中起着关键作用。前期文献报道，改变膳食模式会影响肠道菌群的结构[2]。最近，在大量临床样本和动脉粥样硬化易感小鼠模型中研究发现：小肠微生物代谢膳食磷脂酰胆碱、胆碱和左旋肉碱产生TMAO，促进动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)和心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)的进程[3-8]。该发现已经受到国内外研究者的广泛关注。胆碱是机体细胞膜的重要组成部分，是维持人体肝脏和肌肉正常功能所必需的一种营养素[9-10]。膳食胆碱可以从日常生活中获得，如红肉和鸡蛋，但也可以化学合成。然而，在生活中，特别在西方膳食模式下，人们会摄入大量高胆碱食物。目前，关于高膳食胆碱与健康小鼠肠道微生态之间的联系却鲜有报道。

因此，笔者建立1%的膳食胆碱健康小鼠模型，应用宏基因组测序及相关测定方法，研究高胆碱饮食对肠道菌群及代谢的影响，以期进一步探索胆碱生理功能，为人们合理、健康的饮食提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

20 只SPF(无特定病原体，Specific pathogen free)级健康C57BL/6J小鼠，雌雄各半，体重(20±2) g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，寄养于浙江工业大学实验动物中心动物房；1%胆碱饲料购自上海福贝世亨实验动物饲料有限公司，成分见表1；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸均购自Sigma-Aldrich；小鼠脂多糖ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；锌和铁标准品购于国家有色金属和电子材料分析测试中心。

表1 小鼠饲料营养成分Table 1 Nutrient contents of mice fodder

1.2 实验样本与处理

20 只C57BL/6J小鼠饲养于昼夜交替环境中，实验用水和食物均采用高温消毒灭菌。小鼠适应环境一个星期后，随机平分成两组，即正常组(CK)和1%膳食胆碱组(CHO)。CK组小鼠不做处理，摄入普通饲料；CHO组每天饲喂含1%的高胆碱饲料。每周记录小鼠体重，观察小鼠成长情况。在实验前后分别收集新鲜小鼠粪便，-20 ℃保存备用。实验周期为60 d，处死前禁食12 h，眼球取血，脱颈处死，血液样品存于-20 ℃下待用。

1.3 DNA提取

收集CK和CHO组实验前后每只小鼠200 mg粪便，同组混合，共4 个样本。即对照组(CK组)和胆碱组(CHO组)分别在0 d和60 d收集的小鼠粪便。利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒从粪便中提取混合宏基因组DNA。

1.4 高通量测序和生物学分析

首先将提取得到的肠道DNA进行PCR扩增和纯化回收，然后利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照质量比1∶1等量混合后测序。

1.4.1 原始序列数据

Illumina MiseqTM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，其中包含测序序列的序列信息以及其对应的测序质量信息。

1.4.2 数据预处理

Miseq测序序列中含有barcode序列，以及测序时加入的引物和接头序列。首先需要去除引物接头序列，将成对的序列拼接成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数据。

1.4.3 去除嵌合体及非特异性扩增序列

在PCR反应过程中，会由于延伸不完全产生一些嵌合体，同时也会产生一些非特异性扩增序列。为了保证信息分析质量，必须对其进行剔除。使用Usearch去除预处理后序列中非扩增区域序列，而后对序列进行测序错误校正，并调用Uchime进行鉴定嵌合体。随后，再将去除嵌合体的序列与数据库代表性序列进行Blastn比对，低于阈值的比对结果被认为是靶区域外序列，并剔除掉该部分序列。

1.4.4 肠道菌群组成的生物学分析

众多序列按其序列间的距离进行聚类，然后根据序列与序列间的相似性当作域值分为操作分类单元(OTU)，一般域值的序列相似性设定为0.97，则被认为可能属于属。对处理后序列进行物种分类，采用的软件为RDP classifier，RDP classifier是基于Bergey’s taxonomy，采用Naïve Bayesian assignment算法对每条序列在genus水平上计算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分类阈值，则说明此分类结果可信(测序片段长度<250时可适当调低此值到0.5，如只测V3，V6，V4区。Bergey’s taxonomy分为6 层，它们依次为域(domain)、门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)。本实验主要在门纲目科属水平上进行优势菌群的分析，探索1%胆碱饮食对小鼠肠道菌群组成的影响。

1.5 粪便SCFA测定

取100 mg粪便样品置于10 mL离心管中，加入1.6 mL去离子水溶解，涡旋振荡2 min，加入0.4 mL体积分数为50%的硫酸溶液和1.5 mL乙醚，250 r/min的摇床中摇晃45 min，然后3 000 r/min离心5 min。取上清液于干净的试管中，加入10 mg无水氯化钙脱水，过0.22 μm滤膜，乙醚定容至1 mL进样安捷伦气相色谱。

色谱条件如下：色谱柱为菲罗门ZB-FFAP色谱柱；程序升温条件为100 ℃保留2 min，8 ℃升到240 ℃保持10 min后230 ℃运行10 min；进样口温度250 ℃；FID 350 ℃；以N2为载气，流速为1.69 mL/min。

1.6 血浆中LPS测定

采用小鼠(Mouse)脂多糖ELISA检测试剂盒，操作如下：1) 室温平衡20 min后从铝箔袋中取出所需板条；2) 设置标准品和样本孔；3) 标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样本孔先加待测样品20 μL，再加样本稀释液30 μL，空白孔不加；4) 标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min(空白孔不加)；5) 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5 次；6) 每孔加入终止液50 μL，15 min内于450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.7 粪便微量元素测定

采用原子吸收分光光度法(AAS)测定粪便中微量元素铁和锌的质量分数。1) 称取60 mg干燥后的粪便，加入5 mL 体积分数为65%的硝酸和2 mL高氯酸过夜；2) 隔天样品在电炉加热矿化至冒白烟颜色澄清，然后澄清液转移至容量瓶，去离子水定容到25 mL，过膜备用；3) 空白组制备方法同样品(不加入粪便)；4) 建立标准曲线：用去离子水稀释标准品制备0.1，0.5，1，2，5 mg/L的标准品溶液。

1.8 统计学处理

两组实验的定量数据结果用均值±标准差(SD)表示。统计分析采用GraphPad Prism 7软件进行T检验分析(GraphPad software, La Jolla, CA)。P值小于0.05被认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 膳食胆碱对小鼠体重的影响

如图1所示，各组小鼠的体重随着时间的增长而增加，行动活跃，被毛平整光滑，饮食情况无明显变化并且在整个实验过程中都保持健康，说明长期摄入1%胆碱饮食对小鼠健康没有显著影响。

图1 小鼠体重随时间变化图Fig.1 Body weight of mice changes over time

2.2 膳食胆碱对小鼠肠道菌群组成的影响

肠道菌群由上万亿个典型的不致病的共生微生物组成，在维持机体正常代谢和生理功能中起重要作用[11]。肠道菌群组分和功能的改变在慢病的发生发展中有重要作用，维持肠道菌群组分的平衡稳定是决定宿主健康的重要因素。目前，1%胆碱饮食对健康小鼠肠道微生态的作用研究较少，因此，笔者探索了1%胆碱膳食对小鼠肠道菌群的影响。

2.2.1 膳食胆碱对小鼠肠道菌群门水平组成的影响

由图2可知：实验前后各组小鼠门水平上肠道菌群主要的优势菌为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，它们的丰度占总菌属80%以上。低丰度的菌群包括软壁菌门(Tenericutes)和放线菌门(Actinobacteria)。处理60 d后，CHO组厚壁菌门丰度增加，拟杆菌丰度降低，提高了厚壁菌丰度与拟杆菌丰度的比值，而CK组趋势则相反。由各组处理前后门水平菌群丰度变化可知，1%胆碱膳食能显著影响肠道菌群组成。

CK—对照组；CHO—膳食胆碱组；1—实验处理前；2—实验处理后。图2 膳食胆碱对小鼠肠道菌群门水平的影响Fig.2 Effects of choline diet on gut microbiota on phylum level

2.2.2 膳食胆碱对小鼠肠道菌群属水平组成的影响

由图3可知：在属水平上，各组丰度较高的菌主要为毛螺杆菌NK4A136组(LachnospiraceaeNK4A136 group)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、厌氧支原体属(Anaeroplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、另之菌属(Alistipes)和叶杆菌属(Phyllobacterium)。其中，与CK组相比，1%胆碱饮食干预后毛螺杆菌NK4A136组和另之菌属丰度增加，属于有益菌，与肠道抗炎相关[12-13]。图3中颜色深浅代表实际样本菌群丰度高低。

图3 膳食胆碱对小鼠肠道菌群属水平的影响Fig.3 Effects of choline diet on gut microbiota in genus level

2.2.3 胆碱饮食处理对TMAO相关菌的影响

小鼠粪便菌群16s RNA基因组经PCR扩增之后进行宏基因组测序，分析了膳食胆碱处理后TMAO产生相关菌的丰度变化，结果如图4所示。

图4 膳食胆碱对TMAO产生菌的影响Fig.4 Effects of choline diet on TMAO producing bacteria

由图4可知：与CK组相比，高胆碱膳食显著增加厚壁菌门、梭菌目(Clostridiales)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)丰度，降低拟杆菌门、拟杆菌目(Bacteroidales)的丰度，而对变形杆菌门和颤杆菌克属(Oscillibacter)丰度影响小。胆碱作为机体日常必需的一种营养素，广泛存在于鸡蛋、红肉和鱼肉中。前期无菌小鼠和人体实验研究表明，厚壁菌门和变形菌门与TMAO产生相关[14]。而Cho等发现健康志愿者摄入TMAO前体食物后，可造成体内厚壁菌门增加和拟杆菌门缺乏，其与TMAO产生相关[15]。在本研究中，高胆碱饮食可显著增加厚壁菌门/拟杆菌门丰度的比例，这与以往的报道相一致。同时，梭菌目、瘤胃球菌科、梭菌属(Clostridirales)、颤杆菌克属(Oscillibacter)以及链球菌属(Streptococcus)的丰度与血浆TMAO水平具有相关性[16-18]。梭菌目被认为含有代谢膳食胆碱生成TMAO的CutC/D基因[19]。在本研究中，1%胆碱饮食对TMAO相关菌丰度的影响与前期研究报道一致。以上数据表明：高胆碱饮食能提高肠道TMAO产生菌的丰度，具有促CVD产生的风险。

2.3 膳食胆碱消耗提高粪便SCFA质量分数

SCFA是肠道菌群利用宿主不易消化的糖类、蛋白或内源性底物等酵解而产生的重要代谢产物，其组成和总量可以间接反应人体厌氧菌的数量和代谢情况，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸[20-21]。以往研究揭示：SCFA具有多种生理功能，包括供能、促进脂肪和糖代谢、改善肠道微循环、抗炎和免疫调节的作用[22]。在本研究中，1%胆碱饮食对粪便SCFA的影响如图5所示。与CK相比，CHO组乙酸质量分数显著增加，而丙酸、丁酸和戊酸的质量分数没有显著差异。以上数据表明：对于健康小鼠，高胆碱膳食能促进乙酸的产生。图5中*代表P<0.05。

图5 粪便中短链脂肪酸质量分数Fig.5 The contents of SCFA in mice feces

2.4 高胆碱饮食对粪便微量元素的影响

铁和锌是两种人体重要的微量营养元素，其在肠道内被吸收，转运到肝脏、肌肉和血液利用，而后通过粪便、尿液和汗水排出。如图6所示，相对于CK组，CHO组显著增加粪便Fe的质量分数，而Zn的质量分数没有显著性变化。早期文献报道：体内低水平的Fe能提高与其他毒性金属作用的敏感性，保护机体健康[23]。本研究CHO组小鼠粪便中Fe的质量分数增加，说明高胆碱膳食促进体内Fe的排出。图6中*代表P<0.05。

图6 膳食胆碱对粪便微量元素的影响Fig.6 Effects of choline dietry on trace nutrition elements in feces

2.5 高胆碱饮食对血浆LPS水平的影响

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一，高水平的细菌LPS会从肠腔进入血液引起体内毒素血症和全身性的低度炎症[24]。肠黏膜屏障是肠道健康的生物屏障，能阻止有害物质进入血液，如LPS。由图7可知：CHO组小鼠血浆LPS浓度显著降低。最近Zhang等研究报道，补充0.5%的胆碱能明显改善孕妇血清LPS和炎症水平[25-28]，笔者研究结果与前期文献相类似。1%胆碱饮食对肠黏膜屏障具有保护作用。图7中*代表P<0.05。

图7 血浆LPS浓度Fig.7 The concentration of plasma LPS

3 结 论

1%高胆碱饮食可影响健康小鼠肠道微生态，其作用表现在正负两个方面：1) 1%高胆碱饮食能提高肠道抗炎相关菌毛螺杆菌NK4A136组的丰度，增加粪便中SCFA含量，并降低血浆中LPS的水平，起到保护肠黏膜屏障作用；2) 1%高胆碱饮食提高了TMAO相关产生菌厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科的丰度，具有增加CVD的风险。因此，如何合理、安全地利用胆碱将是未来重要的研究课题。