自发性糖尿病食蟹猴的诊断及其骨微结构的改变

贾欢欢，罗晓玲，高洪彬，梁十，罗挺，陈结文，何积存，黄庆宇，李永锋，卢丽*，陈梅丽*

(1. 广东省实验动物监测所；广东省实验动物重点实验室，广州 510663； 2. 广东药科大学生命科学与生物制药学院，广州 510006； 3. 广州春盛生物研究院有限公司，广州 510940)

骨质疏松是糖尿病常见的并发症，有研究报道糖尿病患者骨密度下降且骨脆性增加，骨折风险高于正常同龄人[1-3]。目前糖尿病并发骨质疏松(diabetic osteoporosis，DOP)的病因不明且无良好的治疗药物。有研究者认为糖尿病作为一种内分泌代谢失常的疾病，其体内钙、磷、镁等电解质代谢紊乱可能是导致患者骨结构改变的重要原因[4]。

良好疾病动物模型的缺乏是制约DOP发病机理及治疗方法研究的瓶颈，特别是与人类遗传谱系更加接近的非人灵长类疾病动物模型。现有DOP模型主要是通过药物诱导或自发糖尿病动物加去卵巢方式构建，主要为啮齿类的大小鼠模型，这些模型造模方法与人类DOP的发病方式差异较大，且啮齿类动物与人类遗传谱系差异较大，并非良好的DOP疾病动物模型[5]。因此,建立非人灵长类DOP模型将对DOP的研究起到一定的推动作用。

徐传磊等[6]研究发现食蟹猴正常空腹血糖为(5.10 ± 1.89)mmol/L，当食蟹猴空腹血糖≥8.0 mmol/L且持续3周以上，或糖耐量实验中葡萄糖负荷后120 min时血糖≥10.0 mmol/L时，只要满足其一即可确诊糖尿病。结合我们前期研究结果，综合上述糖尿病食蟹猴确诊条件，本研究将综合分析正常食蟹猴与自发糖尿病食蟹猴骨结构的差异，为DOP模型的建立提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

13 ～ 20岁普通级雌性自发糖尿病食蟹猴4只，同年龄段普通级雌性正常食蟹猴5只。由广东春盛生物科技发展有限公司提供【SCXK(粤)2014-0027】，饲养于广东春盛生物科技发展有限公司普通环境动物设施【SYXK(粤)2017-0176】。饲养环境：室温20 ～ 26℃，相对湿度4%～70%，12 h/12 h 昼夜明暗交替，标准饲料饲喂，自由饮食。

1.1.2 实验试剂

总胆固醇(TCHO)测定试剂盒(广州科方，CH2319)；低密度脂胆固醇(LDL-C)测定试剂盒(广州科方，CH2519)；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒(广州科方，CH2419)；甘油三酯(TG)测定试剂盒(广州科方，TG2219)；肌酐(Crea)测定试剂盒(广州科方，CR2919)；尿素氮(urea nitrogen, BUN)测定试剂盒(广州科方，UR3119))；葡萄糖溶液(科伦药业，189887)；血糖试纸(Roche，2103178)。

1.1.3 实验仪器

快速血糖仪(Roche，爱尔兰)；全自动生化分析仪(日立3100，日本)；Micro-CT扫描系统(日立Latheta LCT-200，日本)。

1.2 方法

1.2.1 分组

实验分为2组，正常对照组(normal group，NG)，5只；自发糖尿病组(spontaneous diabetic group，SDG)，4只。

1.2.2 空腹血糖及糖耐量试验

禁食超过12 h后，根据实验动物体重，以4 mL/kg给动物鼻饲灌胃50%(质量分数)葡萄糖溶液，并于0 min(灌胃前)、10、30、60、90、120 min针刺后肢静脉采血，用快速血糖仪检测血糖。

1.2.3 血液生化检测

禁食超过12 h后，肌肉注射15 mg/kg 氯胺酮对食蟹猴进行麻醉后后肢静脉采血。全血在室温下放置30 ～ 50 min，3000 r/min离心10 min，取血清，用自动生化分析仪检测血液生化学指标，包括总胆固醇(TC)、低密度脂胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、肌酐(Crea)和尿素氮(BUN)等。

1.2.4 骨骼的Micro-CT检查

肌肉注射15 mg/kg 氯胺酮麻醉后放血处死动物，取其股骨及胫骨，放入4%甲醛溶液中固定48 h。运用Micro-CT成像系统对食蟹猴骨骼标本进行扫描。Micro-CT扫描参数为电压80 kV，电流：0.5 mA，层厚：80 μm，分辨率：80 μm，旋转角度：360°。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 动物空腹血糖及糖耐量

空腹血糖检查发现，SDG组食蟹猴空腹血糖值高于NG组，差异有显著性(P< 0.01)，且SDG组动物空腹血糖值大于8.0 mmol/L。糖耐量检测发现，给予葡萄糖10 min后两组血糖值均明显升高，随着时间的延长血糖值开始下降，给予葡萄糖120 min时NG组血糖值恢复正常水平，而SDG组血糖值仍高于10.0 mmol/L，两组间比较差异有显著性(P< 0.01)。(表1)

2.2 血液生化检测

血液生化检测发现，与NG组比较SDG组食蟹猴血清中TG及LDL-C水平升高，差异有显著性(P< 0.01)；HDL-C及Crea水平下降，差异有显著性(P< 0.05)。TC及BUN两组间比较，差异无显著性(P> 0.05)。(表2)

表1 空腹血糖及糖耐量结果Table 1 Results of fasting blood glucose and glucose tolerance ± s,mmol/L)

注：NG为正常对照组，SDG为自发糖尿病组。与NG组比较，*P< 0.05；**P< 0.01。(下同)

Note. NG: Normal group. SDG: spontaneous diabetic group. Compared with the normal group,*P< 0.05,**P< 0.01.(The same in the following table and figures)

表2 血液生化检测结果Table 2 Results of blood biochemical ± s)

2.3 骨骼的Micro-CT检查

2.3.1 骨结构变化

运用VGStudio MAX 2.2进行3D建模发现，与NG组比较，SDG组动物股骨及胫骨骨小梁数量均明显下降，NG组为大量针状或片状的骨小梁连接成多孔的网状结构，而SDG组动物骨小梁间距增大，部分区域骨小梁消失，骨小梁厚度降低，股骨与胫骨区域的骨小梁出现穿孔。(图1)

2.3.2 股骨下段及胫骨上段松质骨变化

与NG组比较，SDG组动物股骨下段松质骨骨小梁面积(Tb.Ar)、骨小梁体积(Tb.V)及骨小梁骨矿含量(BMC)均显著下降，差异有显著性(P< 0.05)；此外与NG组比较，SDG组动物胫骨上段松质骨骨小梁面积(Tb.Ar)、骨小梁体积(Tb.V)及骨小梁骨矿含量(BMC)均显著下降，差异有显著性(P< 0.01)。(图2)

2.3.3 股骨下段及胫骨上段皮质骨变化

NG组与SDG组动物股骨下段及胫骨上段骨矿含量及皮质骨厚度差异无显著性(P> 0.05)。(图3)

3 讨论

图1 自发性糖尿病食蟹猴和对照组动物骨骼三维重建图Figure 1 Three-dimensional bone reconstruction of the normal group and spontaneous diabetic group

图2 自发性糖尿病食蟹猴和对照组动物股骨和胫骨松质骨骨小梁参数Figure 2 Trabecular parameters of cortical bone in the femur and tibia of normal and spontaneous diabetic groups

图3 自发性糖尿病食蟹猴和对照组动物股骨和胫骨皮质骨参数Figure 3 Cortical bone parameters in the femur and tibia of normal group and spontaneous diabetic group

糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌代谢失常疾病，在机体糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱的同时，还能引起钙质及骨代谢的异常[7]。糖尿病表现为“三多一少”即多饮、多食、多尿及体重减少，患者体内大量的钙、镁、磷等元素会随着尿液的排出而大量流失，导致骨骼代谢受到影响，而体内钙的失衡同时会引起机体激素分泌异常，促进骨吸收功能，导致骨量下降和骨结构的破坏，这些都可能是DOP发生的重要因素[8]。目前的研究发现，糖尿病患者在血脂代谢紊乱的同时也常伴随着肾功能的异常[3]，而传统中医理论认为，肾主骨，肾的精气盛衰，直接影响骨骼的生长和功能。有研究发现糖尿病患者和骨质疏松患者均出现血清总胆固醇、甘油三酯及低密度脂胆固醇显著升高，高密度脂胆固醇、肌酐及尿素氮水平的下降[9-10]，因此血脂和肾功能生化指标的检测可作为糖尿病食蟹猴诊断的辅助指标。

基于以上报道，对于糖尿病的诊断主要以空腹血糖与糖耐量试验为主，而血清中血脂及肾功能生化指标作为辅助诊断方法。目前对于食蟹猴糖尿病的诊断并无统一标准，我们采用徐传磊等人的研究结果，食蟹猴空腹血糖≥8.0 mmol/L且持续3周以上，或糖耐量试验中葡萄糖负荷后120 min时血糖≥10.0 mmol/L时，满足其一即可确诊糖尿病[6]。对骨质疏松的诊断主要通过影像学方法，如微量CT或MRI分析骨骼的微结构变化，包括松质骨的骨小梁面积、骨小梁体积及骨矿含量等，皮质骨的厚度及骨矿含量[11]。

我们的研究发现自发糖尿病组食蟹猴空腹血糖值大于8.0 mmol/L，且糖耐量试验中给予葡萄糖120 min时血糖值仍高于10.0 mmol/L，此外与对照组比较自发糖尿病食蟹猴血清中TG及LDL-C水平升高，HDL-C及Crea水平下降，通过以上结果可确诊纳入研究的疾病动物为自发糖尿病食蟹猴。Abdelrahman等[12]研究发现，糖尿病患者的胫骨骨小梁微结构明显破坏，骨小梁数量显著降低，而骨小梁间隙显著增大。本研究中Micro-CT三维重建图显示自发糖尿病食蟹猴的股骨和胫骨的骨小梁数量减少，部分区域骨小梁出现穿孔，甚至出现骨小梁缺失。参数分析显示股骨下段及胫骨上段的骨小梁面积，骨小梁体积及骨小梁骨矿含量等参数均显著降低。以上结果表明，自发性糖尿病食蟹猴的松质骨出现与糖尿病性骨质疏松临床病人相似的骨微结构破坏。此外对皮质骨的检测发现，自发糖尿病食蟹猴与正常食蟹猴比较，股骨和胫骨皮质骨厚度及骨矿含量无显著性差异，但自发糖尿病动物有小幅升高，表明当骨骼中松质骨微结构遭到破坏时皮质骨呈现适应性增厚，以支撑身体抵抗重力，这与生物力学的适应性变化是相符的。

综上所述，本研究中确诊的自发糖尿病食蟹猴骨微结构变差、骨量减少，出现骨质疏松样变化，可作为一种自发的DOP食蟹猴模型，可为DOP发病机理及治疗措施的研究提供研究基础。