动态高压微射流处理顺序对果胶-乳铁蛋白复合物结构及性质的影响

梁瑞红，华 慧，王学栋，李 娅，刘成梅，陈 军*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

蛋白质是构成人类食物的重要组成部分，对食品的色、香、味及结构等起到关键性作用，作为食品原料或添加剂被广泛应用于食品工业[1]。而多糖作为另一种天然存在的重要高分子，其来源广泛，许多天然来源的多糖具有抗糖尿病、抗癌、免疫调节、抗炎等生物活性[2]。但是，蛋白质和多糖因自身的结构及性质限制了其应用范围[3-4]。近年来，大量技术被用于蛋白和多糖改性，如蛋白改性方面有超声波[5]、动态高压微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）[6]、美拉德交联反应[7]、超高压[8]等方法；而多糖改性可通过酶法[9]、微波处理[10]、DHPM[11]、共混[4]等进行。然而，在食品体系中，蛋白和多糖多以共存形式存在，且易发生相互作用，但关于外部物理处理手段对蛋白与多糖共存体系影响的研究还相对较少。

目前，关于物理手段处理蛋白与多糖共存体系的方式主要有先改性蛋白再与多糖复合、先改性多糖再与蛋白复合，以及直接处理蛋白与多糖共存体系。先改性蛋白再与多糖复合的研究方面，丁俭等[12]利用超高压技术预处理大豆分离蛋白再与可溶性大豆多糖复合，复合体系的乳液稳定性得到增强；改性多糖再与蛋白复合的研究方面，Hosseini等[13]发现超声处理后的海藻酸钠与β-乳球蛋白间相互作用减弱且复合物粒子分布更加均匀；而直接处理蛋白与多糖共存体系的研究方面，Albano等[14]研究发现超声波处理可以降低乳清蛋白与果胶复合物粒径，增强其分散稳定性。但目前关于物理手段处理对蛋白与多糖共存体系影响的研究主要是通过采用上述某一种处理方式，而关于3 种不同处理方式对蛋白与多糖共存体系的影响是否存在差异鲜见报道。

DHPM是一种通过高压对液体物料进行高速撞击、强烈剪切、高频振荡等作用的物理改性技术，可以起到超微细化、乳化和均一的效果，进而对物料理化性质产生影响[6]。乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种分子质量约为80 kDa的单链糖蛋白，含有约700 个氨基酸残基，等电点约为8.0，且具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等生物活性[15]。果胶是一种由α-1,4-糖苷键连接D-半乳糖醛酸组成的阴离子多糖[16]，具有优良的凝胶性、增稠性、乳化稳定性等，在食品、医药、日化等行业作为添加剂（如凝胶剂、增稠剂、药物载体等）和功能因子（如预防和治疗癌症、抗氧化和促进肠道等）被广泛应用[17-18]。近年来，乳铁蛋白-果胶复合物的研究备受关注，如乳铁蛋白-果胶复合物作为姜黄素运载体可以改善姜黄素的水溶性、控释性和抗氧化活性[19]；Bengoechea等[20]研究了pH值、多糖/蛋白比例、温度对乳铁蛋白-果胶复合物制备的影响。

基于以上背景，本实验采用DHPM为处理手段，以乳铁蛋白和果胶为研究对象。采用DHPM以3 种顺序进行处理：DHPM预处理乳铁蛋白再与果胶混合（MLFP）、DHPM预处理果胶再与乳铁蛋白混合（MPLF）以及乳铁蛋白与果胶混合后再经DHPM处理（MLFP），制备3 种乳铁蛋白-果胶复合物，探究DHPM处理顺序对复合物溶解性、乳化性和结构的影响，为探讨食品组分在食品加工过程中的结构和性质变化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品级乳铁蛋白（pI≈8.0、分子质量80 kDa、纯度约97.5%） 新西兰Westland乳业公司；果胶（半乳糖醛酸质量分数78.33%、分子质量约为1 273 kDa、酯化度72.65%[21]） 美国CP Kelco公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

M-7125微射流均质机 美国Microfluidica公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；F-7000荧光分光光度计 日本日立公司；MOS-450圆二色光谱（circular dichroism，CD）仪法国Bio-Logic公司；Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪美国Thermo Scientific公司；DW-86L390超低温冰箱青岛澳柯玛超低温冷冻设备有限公司；Alpha1-2LD冷冻干燥机 美国Labconco公司；OCA25光学视频接触角测量仪 德国DATA PHYSICS仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 复合物的制备

在Bengoechea等[20]方法基础上稍作修改制备样品。将果胶、乳铁蛋白分别溶于去离子水，在25 ℃下持续搅拌使其完全溶解，最终配成质量浓度为2.0 mg/mL的母液，即果胶、乳铁蛋白溶液的浓度分别为1.57×10-6、2.50×10-5mol/L。并分别用1.0 mol/L和0.1 mol/L的NaOH溶液将乳铁蛋白与果胶溶液调至pH 7.0，待用。

本研究设计4 个实验组，分别为：空白对照组：将果胶母溶液和乳铁蛋白母溶液按体积比1∶1混匀，形成复合物（空白对照）；实验组1：将经DHPM在80 MPa压力下预先处理的乳铁蛋白溶液（MLF）与未经处理果胶溶液按体积比1∶1混匀，形成复合物（MLFP）；实验组2：将经DHPM在80 MPa压力下预先处理的果胶溶液（MP）与未经处理乳铁蛋白溶液按体积比1∶1混匀，形成复合物（MPLF）；实验组3：取部分空白对照组的混合溶液，采用DHPM在80 MPa下处理，制得复合物MLFP。

所有样品置于室温下2 h左右以形成稳定复合物，最终样品都放置在4 ℃冰箱贮存备用。

1.3.2 ζ-电位和平均粒径的测定

采用粒度仪测定样品溶液的ζ-电位和平均粒径。在25 ℃下测定，温度平衡时间为120 s，每个样品做3 次平行[22]。

1.3.3 荧光光谱测定

采用F-7000型荧光分光光度计分析DHPM处理顺序对复合物内源荧光性的影响。取3 mL样品置于石英比色皿中，激发波长为292 nm[23]，发射波长为290～450 nm，激发、发射的狭缝宽度均为2.5 nm，扫描速率240 nm/min。所有样品均在25 ℃进行测定，每个样品测3 次平行。

1.3.4 溶解度测定

取1 mL样品，在15 000 r/min下离心15 min，取上清液。用考马斯亮蓝G-250法测定上清液中蛋白质量浓度，并以牛血清白蛋白作标准蛋白，测定不同质量浓度蛋白的标准曲线，通过线性回归方程计算出上清液中蛋白质量浓度，溶解度为计算后结果比蛋白总质量浓度，所有实验操作均在室温下进行，每个样品做3 次平行[24]。

1.3.5 乳化性测定

根据Shen Lan等[3]的方法测定样品的乳化性。取9 mL的样品溶液于烧杯中，加入3 mL的玉米油，用高速分散机10 000 r/min分散1 min。立即从烧杯底部吸取50 μL溶液，分别加入5 mL的质量分数0.1%十二烷基硫酸钠溶液，漩涡振荡10 s，在500 nm波长处测定吸光度。乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）按下式计算。

式中：DF是稀释因子（100）；ρ是初始蛋白质量浓度/（g/mL）；L是光程（1 cm）；φ是形成乳液的油体积分数/%；A0是稀释后乳液的吸光度。

1.3.6 界面张力的测定

采用OCA25视频光学接触角测量仪测定复合物吸附的界面张力。将样品置于注射器内，并使注射器上的不锈钢针插入盛有玉米油的玻璃槽内，利用电动注射单元将样品推到不锈钢针的尖端形成15 μL的液滴，立即启动视频摄像系统连续采集液滴的外形图像，检测样品界面张力γ随吸附时间t的变化情况。实验在25 ℃下进行，维持10 min。然后，根据Young-Laplace方程，利用SCA20软件对液滴外形图像分析，计算出t为10 min时，样品的界面张力[12,25]。

1.3.7 圆二色光谱测定

采用远紫外CD仪分析样品二级结构变化。将样品溶液置于光路为0.1 cm的圆形石英比色皿中，扫描范围在190～250 nm，扫描步距分辨率为1.0 nm、扫描速率100 nm/min、谱带宽度2.0 nm。每份样品在25 ℃下测定，重复扫描3 次，采用DichroWeb在线数据库预测二级结构含量[26]。

1.4 数据处理分析

实验数据通过SPSS 16.0软件处理，采用Tukey法对数据进行差异显著性分析（P≤0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著）。每个实验重复3 次，采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 ζ-电位分析结果

-电位的影响Fig. 1 Effect of DHPM treatment sequence on ζ-potential of LF, pectin and LF-P complexes图 1 DHPM处理顺序对乳铁蛋白、果胶、乳铁蛋白-果胶复合物ζ

乳铁蛋白、果胶、乳铁蛋白-果胶复合物经DHPM处理后的ζ-电位变化如图1所示，在pH值为7.0（pH＜pI）时，乳铁蛋白经DHPM处理前后均带有净正电荷，且经DHPM处理后乳铁蛋白溶液的正电荷量增加，这可能是由于DHPM处理使乳铁蛋白团聚物分散成粒径更小的粒子，增大了乳铁蛋白表面积，从而使乳铁蛋白粒子表面暴露出更多的带电基团[27]。果胶溶液经DHPM处理后其表面所带的负电荷减少，这可能是因为DHPM处理导致果胶分子降解成一些短的果胶链，而新形成的果胶短链电荷密度较小[11,13]。目前已经有研究报道，多糖与蛋白质量浓度比对复合物形成具有重要影响，当蛋白质量浓度一定时，随着多糖浓度的不断增加，所带电荷由正电逐渐变成负电，且当多糖浓度增大到一定程度，与蛋白复合达到饱和，此时电位不再变化[28]。在果胶与乳铁蛋白复合体系中，当乳铁蛋白的浓度远大于果胶浓度时，混合液是复合物与大量游离的乳铁蛋白共存，ζ-电位分析结果可能由于大量游离乳铁蛋白的影响而显示为正电荷，而本研究中果胶、乳铁蛋白的浓度分别约为7.85×10-7、1.25×10-5mol/L，两者浓度比约为1∶15，混合后，果胶（—COO-）与乳铁蛋白（—NH3+）发生静电复合从而使果胶包覆在蛋白表面，并且由于果胶为长链大分子，具有许多带负电的游离羧基，从而使复合物带负电荷且带电量均小于果胶溶液，该结果与Bengoechea等[20]的研究结果一致。此外，复合物的负电性为空白对照＞MLFP＞MLFP＞MPLF，这可能是由于DHPM处理顺序不同使果胶链形态存在差异，当单独处理果胶时，导致果胶链的结构变化最大，从而使复合物MPLF的带电量最小。

2.2 荧光光谱分析结果

乳铁蛋白在激发波长为292 nm时，其内源性荧光主要通过色氨酸产生，但由于色氨酸残基所处微环境和三级结构变化易影响色氨酸产生的荧光强度[29]，因此，可以通过荧光光谱（图2）分析DHPM处理顺序对乳铁蛋白与果胶相互作用的影响。首先，DHPM处理使乳铁蛋白的荧光强度增强，表明DHPM处理使乳铁蛋白结构变得更加松散，色氨酸被更多地暴露，而果胶处理前后的荧光强度均接近于0。同时，乳铁蛋白在处理前后的荧光强度均明显大于4 种复合体系，这说明形成复合物会使乳铁蛋白的荧光强度显著降低。且经DHPM处理后复合物荧光强度均小于未经DHPM处理的空白对照。这显然是由于经DHPM处理后，复合物的结构发生变化造成的，原因可能是DHPM使乳铁蛋白和果胶分子伸展度加大且增强了果胶与乳铁蛋白的相互作用，导致色氨酸被包裹在复合物内侧，使荧光强度减小[30]；也可能是乳铁蛋白中色氨酸的氨基（正电）与果胶的羧基（负电）复合使立体结构变化。而复合物MLFP荧光强度最低，这可能是由于复合物MLFP是由DHPM直接处理乳铁蛋白与果胶混合体系，使乳铁蛋白与果胶结合更为紧密，从而使色氨酸被果胶更大程度地包裹在复合物内侧[29]。

图2 DHPM处理顺序对乳铁蛋白、果胶、乳铁蛋白-果胶复合物的荧光光谱的影响Fig. 2 Effect of DHPM treatment sequence on fluorescence spectra of LF, pectin and LF-P complexes

2.3 CD分析结果

采用CD分析DHPM处理顺序对复合物中乳铁蛋白二级结构影响，结果如图3所示，所有样品在210～220 nm波长处有一较宽的负峰，在190～200 nm波长处存在一个明显的正峰，这表明经DHPM处理前后，复合物中的乳铁蛋白二级结构均以β-折叠为主[31]。通过利用DichroWeb在线数据库对所测得的图谱进行分析计算，测得二级结构组成与比例，如表1所示，经DHPM处理后，复合物的α-螺旋相对含量均有所减少，β-折叠相对含量均增加，而β-转角和无规卷曲含量无明显变化，表明维持螺旋结构的氢键排布发生变化，使复合物中乳铁蛋白的结构变得更加松散，柔性结构含量增加[32]。且与空白对照相比，MLFP的α-螺旋含量变化最显著，这是由于DHPM直接处理乳铁蛋白，使蛋白结构改变；而MLFP的α-螺旋含量变化相对较小，这可能是由于果胶包覆在蛋白表面，减弱了DHPM处理对乳铁蛋白结构的影响。

图3 DHPM处理顺序对乳铁蛋白-果胶复合物二级结构的影响Fig. 3 Effect of DHPM treatment sequence on secondary structure of LF-P complexes

表1 DHPM处理顺序对乳铁蛋白-果胶复合物二级结构相对含量的影响Table 1 Effect of DHPM treatment sequence on secondary structure content of LF-P complexes

2.4 粒径分析结果

DHPM处理顺序对乳铁蛋白、果胶、乳铁蛋白-果胶复合物的粒径影响如图4所示，空白对照、MLFP、MLFP、MPLF的粒径分别为391.00、275.73、375.63、259.60 nm，表明DHPM处理使复合物粒径均减小。沙小梅等[33]研究也发现DHPM处理会减小大豆蛋白-大豆多糖复合物粒径。经处理后的乳铁蛋白粒径减小，这可能是由于DHPM处理使蛋白团聚物发生一定解聚[34]，而果胶经DHPM处理后粒径减小则可能是由于果胶分子链发生断裂[11]，粒径的变化证实了上述推论，即乳铁蛋白、果胶带电荷量变化是由于DHPM处理使其结构、粒径变化所造成的。且复合物粒径为空白对照＞MLFP＞MLFP＞MPLF，这可能是由于复合物的粒径主要受果胶结构的影响，DHPM处理顺序的不同使复合物中果胶链形态存在差异，如复合物MLFP中果胶以完整的分子链包覆在蛋白表面，而MPLF和MLFP中果胶均受到DHPM处理的影响，但MLFP是由DHPM直接处理乳铁蛋白与果胶混合体系，乳铁蛋白分担了部分DHPM的机械影响，从而使果胶链的结构变化不如MPLF明显，最终导致形成不同粒径的复合物。

图4 DHPM处理顺序对乳铁蛋白、果胶、乳铁蛋白-果胶复合物粒径的影响Fig. 4 Effect of DHPM treatment sequence on Z-average diameter of LF, pectin and LF-P complexes

2.5 分散性分析结果

表2 DHPM处理顺序对乳铁蛋白-果胶复合物的溶解度、EAI及界面张力的影响Table 2 Effects of DHPM treatment sequence on solubility, emulsifying activity index, and interfacial tension of LF-P complexes

经不同顺序DHPM处理后复合物的分散性通过测定复合物中乳铁蛋白的溶解度来分析，如表2所示，DHPM处理均显著提高了复合物中乳铁蛋白的溶解度（P＜0.05），且MLFP＞MPLF＞MLFP＞空白对照，溶解度依次为92.17%、90.32%、83.26%、80.31%。通过上述粒径分析结果可知DHPM处理使复合物粒径减小，这可能增大了复合物粒子被结合水覆盖的表面积，从而使复合物的分散性增强[35]。但MLFP粒径大于MPLF，而分散性却是MLFP大于MPLF，这可能是由于复合物MLFP在经DHPM处理时，乳铁蛋白一定程度上抑制了果胶链断裂，使较长的果胶链包覆在乳铁蛋白表面，抑制复合物聚合，进而提高复合物的分散稳定性[36]。

2.6 乳化性分析结果

DHPM处理顺序对乳铁蛋白-果胶复合乳化性的影响结果如表2所示，复合物MLFP、MLFP、MPLF的EAI均显著小于未经DHPM处理的空白对照（P＜0.05），且MLFP＞MPLF＞MLFP。经DHPM处理后复合物乳化性均降低，原因可能是DHPM处理使复合物结构发生变化，导致复合物表面的疏水性基团数量减少，从而降低了其乳化特性[34]。MLFP和MPLF的乳化性大于MLFP，这可能是因为DHPM处理使果胶分子链发生断裂，导致复合物MLFP和MPLF的疏水性基团相较于MLFP被更多地暴露出来，从而使复合物MLFP的乳化性相对较低；而MLFP的乳化性大于MPLF，则可能是由于DHPM直接处理乳铁蛋白与果胶混合体系时，果胶链发生断裂的同时，乳铁蛋白蛋白的结构也变得更加松散，从而使复合物MLFP表面相较于经DHPM其他顺序处理的复合物所暴露的疏水性基团较多。

2.7 界面张力分析结果

界面行为对于乳液的制备及稳定具有重要意义，复合物在油-水界面快速吸附，迅速降低界面张力，可以增强乳液稳定性，阻止油滴的聚集。因此可以通过界面张力表征复合物的乳化特性。DHPM处理顺序对乳铁蛋白-果胶复合物界面张力的影响如表2所示，经DHPM处理的复合物界面张力均显著大于未经处理的空白对照（P＜0.05），且MLFP＞MPLF＞MLFP＞空白对照。界面张力的增加表明复合物表面活性的降低[37]，这与上述乳化性分析结果一致。可能的原因是DMHP处理使乳铁蛋白-果胶复合物的结构发生变化，导致表面的疏水性基团数量减少，提高了复合物吸附垒能，降低吸附效率[12]，从而使界面张力增大。

3 讨 论

本研究通过DHPM以不同顺序处理，制备出3 种不同的乳铁蛋白-果胶复合物，并探究DHPM处理顺序对复合物结构及性质的影响。根据上述结果和分析，对DHPM处理顺序影响乳铁蛋白-果胶复合物形成的机理进行初步推断（图5）。复合物MLFP的制备是通过DHPM先处理乳铁蛋白，使乳铁蛋白解团聚，结构变得松散后与未经处理的果胶链静电复合而成，相较于其他两种制备方式，其粒径较大，乳化性和分散性均最低；复合物MPLF则是通过DHPM先处理果胶，使果胶链断裂后与乳铁蛋白复合，形成最小粒径的复合粒子；而复合物MLFP则是先将乳铁蛋白与果胶直接形成较大的复合粒子后，再经DHPM处理，此时果胶与乳铁蛋白之间存在一定交互影响，使DHPM对蛋白与果胶结构影响减弱，形成粒径相对较小的复合粒子，且分散性和乳化性最高。

图5 DHPM处理顺序对乳铁蛋白-果胶复合物形成影响的示意图Fig. 5 Schematic diagram of effect of DHPM treatment sequences on formation of LF-P complexes

综上，本研究得出以下结论：DHPM处理后使复合物的分散性增强、乳化性减小；经DHPM处理后的3 种复合物中，MLFP的分散性和乳化性最强，而MLFP的分散性和乳化性最弱，这与界面张力分析结果一致；经DHPM处理的复合物粒径也显著减小，且MPLF＜MLFP＜MLFP＜空白对照；粒径和CD分析表明3 种复合物的结构也存在差异，MLFP中乳铁蛋白经DHPM处理使蛋白团聚物发生解离且结构变得更加松散，MPLF中的果胶经DHPM处理则发生断裂，而MLFP则是DHPM直接处理乳铁蛋白和果胶混合体系，果胶和乳铁蛋白分子间存在交互影响，一定程度上减弱了DHPM对复合物结构的影响；ζ-电位和荧光光谱分析结果表明，果胶和乳铁蛋白复合物主要通过两者间的静电作用形成，且DHPM处理促进果胶与LF的相互作用。本研究为探讨食品组分在食品加工过程中的结构和性质变化提供一定的理论依据。