Bacillus pumilus HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌机理

郭 娟，贠建民*，邓展瑞，艾对元，张紊玮，赵风云

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

粉红单端孢（Trichothecium roseum）是一种引起果蔬采后病害的致病微生物[1]，它不但会导致果蔬红粉病，还会产生对人和动物有害的单端孢霉烯族毒素，造成食品安全问题，引起食品源头的污染[2-4]。目前对红粉病病害的控制方法以化学药物控制为主，但化学药物控制容易引起微生物抗药性，且化学药物对环境也存在危害或潜在危害[5]，因此，寻找化学药物替代品也成为目前研究的一大热点。

抗菌肽是一种具有生物活性的蛋白类物质，其对微生物的抑制具有广谱性，对真菌、细菌甚至病毒都具有抑制作用[6]，且不易产生耐药性，因此有望成为化学药物替代品，应用潜力和价值巨大。我国对抗菌肽的研究起步较晚，而且抗菌肽生产成本较高，对其抑菌机理研究尚不够深入，其在农业生防方面应用较少[7]。目前主要从胞内及胞外作用两大方面研究抗菌肽的抑菌机理[8]；例如Li Lirong等发现了一种能够抑制白色念珠菌的抗菌肽，其能够导致细胞膜去极化，破坏细胞膜，然后进入细胞内部，将细胞阻滞在S期，造成细胞死亡[6]；Han Jinzhi等研究了AMP-jsa9对白色念珠菌的抑菌机理，发现AMP-jsa9能够破坏白色念珠菌的细胞壁和细胞膜，导致细胞膜通透性增加，跨膜运输受到抑制，应激反应下降，影响菌体新陈代谢，从而抑制菌体的生长[9]。有些抗菌肽还能够通过抑制酶活性来达到抑菌目的；两栖动物抗菌肽Carein1.8能够抑制大肠杆菌的ATP酶合成达到抑菌作用[10]；副干酪乳杆菌FX-6产生的抗菌肽F1能够抑制金黄色葡萄球菌的β-半乳糖苷酶的表达，同时抑制核酸的合成，从几个方面造成细菌的死亡[11]。

本实验所用抗菌肽P-1是一种新型阳离子抗菌肽，由本研究组分离纯化于短小芽孢杆菌HN-10（Bacillus pumilus HN-10），其氨基酸序列为GGSGGGSSGGSIGGR，分子质量为1 149.14 Da，对粉红单端孢具有很强的抑菌活性，最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）为1 µg/mL，但其抑菌机理尚不明确[12-13]。本实验以粉红单端孢为靶标菌，研究抗菌肽P-1对其细胞膜通透性、蛋白合成和核酸合成3 个方面的影响，以期阐明抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌机理，为抗菌肽P-1的应用提供科学指导和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

抗菌肽P-1分离纯化于短小芽孢杆菌HN-10。粉红单端孢购于中国微生物菌株保藏中心，于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基上生长及保存。

真菌蛋白提取试剂盒 上海贝博生物有限公司；Ezup柱式真菌基因组提取试剂盒 上海生工生物工程有限公司；溴化乙锭（ethidium bromide，EB）、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LRH生化培养箱、THZ-98A恒温振荡器 上海一恒科技有限公司；GelDoc XR凝胶成像系统照明、小型垂直电泳槽 美国Bio-Rad公司；DDS-307A电导率仪上海仪电科学仪器股份有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机 湖南湘仪仪器有限公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪 美国Thermo Scientific公司；RF-5301荧光分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽P-1对粉红单端孢细胞膜通透性的影响

1.3.1.1 大分子释放量的测定

参照Paul等[14]的方法并稍作修改，将粉红单端孢培养至对数期（24 h），用PDA液体培养基重悬后，在150 mL菌悬液中加入500 µL 0.9 mg/mL抗菌肽P-1，使其终质量浓度为3 MIC（处理组），对照组加入等体积的无菌蒸馏水，于28 ℃ 120 r/min摇床培养，每隔2 h取10 mL菌悬液，6 000 r/min离心10 min后弃沉淀，分别测定上清液在260 nm和280 nm波长处的吸光度，每组3 次重复，数据取平均值。

1.3.1.2 电导率的测定

参照刘梦茵等[15]的方法，将培养至对数期的粉红单端孢用新鲜PDA液体培养基重悬后，加入抗菌肽P-1使其质量浓度为MIC，对照组加入等体积的无菌蒸馏水；每隔2 h取培养液10 mL，6 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液用电导率仪进行测定，实验重复3 次，数据取平均值。

1.3.2 抗菌肽P-1对粉红单端孢胞内蛋白合成的影响

1.3.2.1 对胞内蛋白含量的影响

参照郝刚等[16]的方法并稍作修改，将粉红单端孢培养至对数期后，6 000 r/min离心10 min，收集菌体并用液体PDA培养基重悬为1×108CFU/mL菌悬液，在150 mL菌悬液中加入500 µL 0.9 mg/mL抗菌肽P-1，使其终质量浓度为3 MIC，对照组加入等体积无菌蒸馏水，于28 ℃培养，分别取培养2、4、6、8、10、12 h的菌悬液10 mL离心，取菌体沉淀用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次。将沉淀转移至研钵，用液氮将菌体研磨为粉末后加入500 µL预冷的20%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）和400 µL纯水，冰浴10 min后离心取沉淀。用10% TCA再次重悬取沉淀，将菌体转移至无菌试管中，加入100 µL生理盐水重悬，再加入5 mL考马斯亮蓝染色液，室温放置30 min后在595 nm波长处测定吸光度，实验设置3 个平行，取平均值。

1.3.2.2 SDS-PAGE分析胞内蛋白

参考陈飞龙等[11]的方法并稍作修改，将培养至对数期的粉红单端孢用新鲜PDA液体培养基重悬后，加入抗菌肽P-1使其质量浓度为MIC，对照组加入等体积的无菌蒸馏水，6 h后提取胞内蛋白。粉红单端孢胞内蛋白的提取参照真菌蛋白提取试剂盒说明书的步骤进行，对提取的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。分离胶质量分数为12%，浓缩胶质量分数为4%；每16 µL蛋白溶液中加入4 µL蛋白上样缓冲液（5×），沸水浴5 min，至蛋白充分变性后冷却至室温，吸取15 µL上样，电压80 V，至样品到达分离胶边缘时加压至120 V，直至样品移动至距胶底端1 cm结束，将胶板取下染色后置于凝胶成像系统观察。

1.3.3 抗菌肽P-1对粉红单端孢核酸的影响

1.3.3.1 凝胶阻滞作用分析

粉红单端孢基因组用Ezup柱式真菌基因组提取试剂盒按照说明书操作步骤进行提取。凝胶阻滞作用的分析参照Miao Jianyin等[17]的方法并稍作修改，基因组质量浓度用微型分光光度计测定，使OD260nm/OD280nm≥1.9，然后进行质量分数1%琼脂糖凝胶电泳分析。取5 µL粉红单端孢基因组，分别加入5 µL不同质量浓度（MIC、2 MIC、3 MIC、4 MIC、5 MIC）的抗菌肽P-1溶液，对照组加入5 µL无菌水，室温放置30 min后加入2 µL上样缓冲液，吸取10 µL上样，电压90 V，待样品移动至距胶板1 cm左右时停止电泳，取下胶板置于凝胶成像系统观察。

1.3.3.2 与EB竞争性结合DNA分析

参照陈旋等[18]的方法并进行一定修改，用蒸馏水将粉红单端孢DNA稀释为50 µg/mL，每1 mL DNA溶液加入15 µL 100 µg/mL EB溶液。反应液混匀后于28 ℃避光孵育10 min。加入1 mL不同质量浓度（MIC、2 MIC、3 MIC、4 MIC）的抗菌肽P-1溶液，对照组加入等体积的无菌蒸馏水。反应液混匀后置于生化培养箱中28 ℃避光孵育30 min。用荧光分光光度计扫描反应液在550～750 nm波长范围的荧光强度（激发波长535 nm、发射波长550 nm）。

1.3.3.3 对粉红单端孢体内DNA和RNA合成的影响

参照Li Lirong等[19]的方法并稍作修改，收集对数期粉红单端孢细胞，用PBS清洗2 遍后重悬为1.0×106CFU/mL的菌悬液。加入抗菌肽P-1溶液使其终质量浓度为MIC，混匀后于28 ℃、120 r/min振荡培养，每隔2 h取样9.85 mL，加入150 µL DAPI染色液（终质量浓度15 µg/mL），避光振荡10 min后用荧光分光光度计分别测定真菌DNA荧光强度（激发波长364 nm、发射波长460 nm）和RNA荧光强度（激发波长400 nm、发射波长460 nm）。

1.4 数据统计与分析

用Excel 2007软件进行平均值及标准差计算，所有数据均为3 次重复所得，用SPSS 19.0软件对数据进行t检验；采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽P-1对粉红单端孢细胞膜通透性的影响

2.1.1 大分子释放量分析

图1 抗菌肽P-1对粉红单端孢的大分子释放量影响Fig. 1 Effect of antimicrobial peptide P-1 on macromolecular release from T. roseum

如图1所示，处理组粉红单端孢的蛋白和核酸释放量都明显高于对照组。其中，处理组粉红单端孢上清液的蛋白含量在0 h时较对照组高，但二者差异不显著（P＞0.05），这可能是抗菌肽P-1的存在所致。随着处理时间的延长，尤其在4 h之后，二者差距逐渐增大，处理组蛋白的释放量远高于对照组（图1A）。处理组核酸释放量也较对照组出现明显的差异（图1B），在4 h后上清液中的核酸含量急剧上升，并且与对照组相比差异显著（P＜0.05）。因此可以推测，抗菌肽P-1能够导致粉红单端孢的细胞膜损伤，使大分子物质外泄。但关于膜损伤的原因是由抗菌肽P-1直接导致还是由抗菌肽P-1通过其他方式杀死细菌后膜自然裂解造成，还需进一步探讨。

2.1.2 电导率分析

图2 抗菌肽P-1对粉红单端孢电导率的影响Fig. 2 Effect of antimicrobial peptide P-1 on electrical conductivity of T. roseum

如图2所示，经过抗菌肽处理的粉红单端孢上清液的电导率明显高于对照组，并且在2 h时就已有显著差异（P＜0.05），因此可以推断抗菌肽P-1首先导致了粉红单端孢胞内电解质释放，再随着处理时间的延长引起大分子物质的释放。

2.2 抗菌肽P-1对粉红单端孢胞内蛋白的影响

2.2.1 胞内蛋白相对含量分析

图3 抗菌肽P-1对粉红单端孢胞内蛋白相对含量的影响Fig. 3 Effect of antimicrobial peptide P-1 on intracellular protein content of T. roseum

从图3可以看出，未加抗菌肽的对照组粉红单端孢菌胞内蛋白相对含量呈现稳定的增长趋势，而添加了抗菌肽P-1的粉红单端孢胞内蛋白相对含量在前4 h内呈现增长趋势，这可能是由于此时抗菌肽P-1进入细胞内部，导致膜受损但尚未破裂，胞内蛋白相对含量暂时积累所致；但是从4 h开始，处理组的胞内蛋白相对含量急剧降低。这一方面可能是由于膜损伤导致蛋白外流；另一方面可能是由于菌体的蛋白合成受到了抑制。

2.2.2 胞内蛋白的SDS-PAGE分析

如图4所示，SDS-PAGE分析发现对照组的胞内蛋白条带完整、清晰，而处理组的胞内蛋白出现缺失，并且缺失的部分为分子质量在43.0～97.4 kDa之间的蛋白。因此可以判断，抗菌肽P-1抑制了粉红单端孢的胞内蛋白合成，使菌体生长受阻，进而导致菌体死亡。

图4 SDS-PAGE分析抗菌肽P-1对粉红单端孢胞内蛋白的影响Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the effect of antimicrobial peptide P-1 on intracellular proteins of T. roseum

2.3 抗菌肽P-1对粉红单端孢核酸的影响

2.3.1 凝胶阻滞作用分析

图5 不同质量浓度抗菌肽P-1对粉红单端孢的DNA凝胶阻滞作用Fig. 5 DNA gel retardation of T. roseum did not occur in the presence of antimicrobial peptide P-1 at different concentrations

从图5可以看出，不同质量浓度抗菌肽P-1对粉红单端孢DNA都没有明显的阻滞作用，但对照组和处理组DNA条带的灰度出现明显差异。对照组的粉红单端孢DNA条带清晰，而处理组的DNA条带明显变淡，并且这种作用在MIC时就已经出现。这可能是由于抗菌肽P-1与粉红单端孢DNA存在某种相互作用。实验结果说明抗菌肽P-1虽对粉红单端孢DNA没有凝胶阻滞作用，但其也对DNA造成一定的影响，进而会影响到蛋白的表达。

2.3.2 抗菌肽P-1与EB竞争性结合DNA分析

图6 抗菌肽P-1与EB竞争性结合粉红单端孢DNAFig. 6 Competitive binding of antimicrobial peptide P-1 with EB to DNA of T. roseum

EB是一种可以和DNA结合的荧光染料，其单独存在时荧光强度很弱，当其与DNA镶嵌结合时荧光强度增强[19]；当有抗菌肽和DNA结合时，与DNA结合的EB会被竞争下来，导致荧光强度降低。图6结果显示，未加抗菌肽的粉红单端孢DNA的荧光强度明显高于处理组，并且荧光强度随着抗菌肽质量浓度的增加而下降，说明抗菌肽P-1能够和EB竞争性结合粉红单端孢DNA，使粉红单端孢的基因功能受到影响，从而抑制粉红单端孢的生长。

2.3.3 抗菌肽P-1对粉红单端孢体内DNA和RNA合成的影响

图7 抗菌肽P-1对粉红单端孢胞内DNA（A）和RNA（B）相对含量的影响Fig. 7 Effect of antimicrobial peptide P-1 on DNA (A) and RNA (B)contents of T. roseum

从图7中可以观察出，粉红单端孢体内DNA和RNA相对含量都是对照组明显高于处理组，随着时间延长，差异越来越明显。经抗菌肽P-1处理10 h后，与对照组相比，处理组DNA相对含量降低46%，RNA相对含量降低43%。由于DNA与RNA相对含量下降幅度接近，因此推测抗菌肽P-1可能只影响DNA的合成，由于DNA的减少，RNA相对含量才降低；但也可能是抗菌肽P-1对DNA和RNA都有抑制作用，这还需进一步探讨。总地来说，抗菌肽P-1能够抑制粉红单端孢核酸的合成。

3 讨 论

抗菌肽种类繁多、来源广泛、毒性低且不易产生耐药性，但其抑菌机理还不够明确[20]。目前对抗菌肽抑菌机理的研究主要集中在其对细胞壁、细胞膜的作用机理以及对蛋白和核酸合成的影响方面，但仍未形成统一的结论，仅在作用靶点是细胞膜这方面有较多的研究。申玲[21]发现抗菌肽MAP28可以破坏白色念珠菌的细胞膜，使之形成孔洞，导致细胞内容物外流，从而发挥抑菌作用。这是由于抗菌肽具有阳离子性，它能够和细胞膜静电结合而破坏膜结构，造成微生物的死亡。陈刚等[22]研究了由蜡样芽孢杆菌产生的环状抗菌肽APS对多种真菌的抑菌机理，通过构建脂质体模型，发现它破坏了膜完整性，在膜上形成电流通道，使膜出现孔洞，因而造成内容物外泄而致使细胞死亡。

抗菌肽最先接触到的是菌体细胞壁，细胞壁能维持菌体形状，是菌体的第1道屏障，细胞壁一旦受到破坏，菌体也就受到了抑制，有些抗菌肽就是通过这种机制来发挥抑菌作用的[23]。当抗菌肽透过细胞壁这道屏障后接触到细胞膜，氨基酸残基能够在静电作用下与磷脂双分子层结合，使得抗菌肽的疏水端插入膜上的疏水区而改变膜的结构，形成离子孔道，从而造成内容物外泄，导致细胞受损，达到抑菌目的[24]。还有的抗菌肽能够抑制菌体菌丝的萌发而造成菌体死亡。彭兵等[25]研究了枯草芽孢杆菌分泌的抗真菌肽FV对玉米小班病菌的抑菌机理，发现它抑制了菌体的孢子萌发，使菌丝变形，菌体表面变粗糙并出现褶皱，从而抑制了菌体的生长。

壁膜作用机制是抗菌肽最基础的抑菌机理，其还可侵入细胞内部发挥抑菌作用，关于抗菌肽对核酸作用机制的研究也较多。Sharma等发现人中性粒细胞肽HNP-1对结核分枝杆菌的抑菌作用除了破坏细胞膜外，还可以抑制DNA的生物合成，其能够和DNA结合，将DNA作为其二级靶点来发挥作用[26]。

基于以上研究，本实验通过测定菌悬液的电导率和大分子释放量来确定细胞膜通透性的变化，在抗菌肽P-1处理粉红单端孢2 h后电解质已经开始释放，蛋白和核酸外泄，证明P-1破坏了菌体细胞膜的结构，导致膜破裂，电解质物质和大分子物质外流，这可能是抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌机制之一。本研究进一步通过测定经抗菌肽P-1作用后粉红单端孢菌体胞内蛋白的含量以分析抗菌肽P-1是否抑制了蛋白的合成。结果表明，在抗菌肽P-1处理4 h之后，菌体内蛋白含量明显下降，到6 h时差异显著，因此选择作用6 h后的菌体进行蛋白的提取，并进行SDS-PAGE分析，结果显示粉红单端孢在被抗菌肽P-1处理后部分蛋白条带出现缺失，说明蛋白的合成受到了抑制。

本研究从凝胶阻滞作用、竞争性结合及核酸相对含量变化3 个方面阐述抗菌肽P-1对粉红单端孢核酸的抑菌机理。结果表明，抗菌肽P-1虽未对粉红单端孢DNA有明显的凝胶阻滞作用，但能够影响粉红单端孢的体外DNA，造成DNA活性降低甚至降解DNA，使DNA在琼脂糖凝胶上的条带模糊；竞争性实验说明抗菌肽P-1和EB竞争性结合DNA，但荧光强度下降较缓慢，这可能是由于抗菌肽P-1只是部分和EB竞争性结合粉红单端孢DNA来发挥抑菌作用。综上所述，抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌机理应该是多方面的，其对核酸的影响也只是其中之一。

目前已报道的抗菌肽大多是抗细菌肽，抗真菌肽还较少，对于抗细菌肽抑菌机理的研究也较抗真菌肽更为全面。由于不同细菌和真菌的细胞壁膜组成和结构存在差异，抗菌肽对真菌和细菌的抑菌作用机理也不可能完全相同[27]，因而研究抗真菌肽的抑菌机理更显迫切。

4 结 论

本研究从Bacillus pumilus HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢的壁膜通透性、蛋白合成及对核酸合成的影响3 个方面着手，研究了其抑菌机理。结果表明，抗菌肽P-1增加了粉红单端孢的细胞膜通透性，可引起细胞壁膜的损伤及胞内电解质和大分子物质的释放；抗菌肽P-1抑制了粉红单端孢的蛋白合成，尤其对分子质量在43.0～97.4 kDa之间的蛋白抑制作用明显；而且抗菌肽P-1对粉红单端孢DNA存在一定的影响，可以和EB竞争性结合DNA，抑制了粉红单端孢的DNA和RNA合成。基于本研究结果，可以得出抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌作用是影响其壁膜通透性、抑制蛋白和核酸的合成共同作用的结果。