离子液体预处理对玉米秸秆酶解效率的影响

胡晓会 ，程 力 *，顾正彪 ，洪 雁 ，李兆丰 ，李才明

（1．食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2．江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；3.江南大学 食品营养与安全协同创新中心，江苏 无锡214122）

随着化石能源的日益短缺及环境污染日趋严重，发展和利用产量巨大、来源丰富的绿色可再生资源木质纤维素意义重大。木质纤维素作为地球上最丰富的可再生资源之一[1-2]，主要来源于木材及农作物秸秆，含纤维素、半纤维素和木质素3个主要组分[3]。纤维素是由D-葡萄糖通过1，4糖苷键连接而成的多糖，纤维素中含有大量氢键，难溶于一般有机溶剂[4]；半纤维素是由不同种糖单元组成的复合聚糖[5]；木质素作为细胞壁的主要成分之一，是由苯基丙烷单元通过醚键、碳-碳键连接而成的复杂、无定型的高聚物[6]。木质素和半纤维素通过共价键形成紧密链接并包裹着纤维素，木质素的存在不仅不可逆地吸附纤维素酶，还阻止酶与底物接触[7]。对木质纤维素进行高效酶解并以此为基础转化为燃料乙醇和各类化工产品，需要对其进行预处理以打破木质纤维素的致密结构，除去木质素等抑制组分，并降低纤维素的结晶度。

传统的预处理方法包括物理法、化学法、物理化学法和生物法，但多数存在环境污染大，生产效率低等缺点[8-11]。离子液体是由有机阳离子和有机或无机阴离子构成的在室温或接近室温下熔融的盐。作为新型绿色溶剂，离子液体对木质纤维素组分有良好溶解性能，且具有不挥发、环境污染小、可重复使用等优点[12-13]。纤维素溶于离子液体后，通过加入反溶剂可以使纤维素再生出来，经过过滤、洗涤和干燥就能得到非晶态的、更易被酶解的再生纤维素。另外，通过改变生成再生纤维素的过程与条件，可制成不同结构与形状的纤维素材料，如粉末状、珠状、纤维状及片状等。研究表明，离子液体对木质纤维素各组分的溶解效果与离子液体的种类有关。体积小、极性强的氯离子对纤维素有较好的溶解性，而[BF]、[PF]、[NTf]等阴离子对纤维素的溶解性较差[14]。

目前关于离子液体预处理木质纤维素的研究较少，对纤维素或木质素有较好溶解性的离子液体预处理木质纤维素后底物的酶解效率不一定高[15-16]。为了研究不同类型的离子液体对木质纤维素各组分溶解效果的差异及预处理后底物物料成分、结构及理化性质的改变，及这些改变与酶解效率之间的关系，本论文选用4种不同类型的离子液体：1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐（[Emim]Ac）、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐（[Amim]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐（[Bmim]HSO4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[Bmim]BF4）对木质纤维素进行预处理，比较并分析了木质纤维素成分、形貌和结构的改变对酶解效率的影响，总结出影响木质纤维素酶解效率的主要因素，以期对木质纤维素相关预处理提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

玉米秸秆，由长春大成玉米开发有限公司提供，4种离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐（[Emim]Ac）、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐（[Amim]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐（[Bmim]HSO4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[Bmim]BF4），均购自上海成捷化学有限公司；纤维素酶（ATCC 26921，45 FPU/mL）、碱木质素、微晶纤维素和木聚糖，均购自Sigma公司；浓硫酸、碳酸钙、柠檬酸、柠檬酸钠、3，5-二硝基水杨酸等，均为分析纯试剂，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 纤维素、半纤维素和木质素在离子液体中的溶解度测定 溶解度测定方法参照LEE等[17]的方法稍加改动。[Bmim]BF4对木质素溶解能力较差，取50 mg木质素加入1 g[Bmim]BF4中，90℃下磁力搅拌12 h，10000 r/min离心1 min，取0.1 g悬浮液加入0.9 mL 0.1 moL/L NaOH溶液，以木质素为标准品用分光光度计在280 nm处测定木质素含量；[Amim]Cl、[Bmim]HSO4、[Emim]Ac 对木质素的溶解能力较好，因此，分别取0.5 g木质素加入5 g离子液体中，90℃下磁力搅拌，若完全溶解，再加0.5 g木质素，12 h内累计木质素添加量为其溶解度。

4种离子液体的纤维素和半纤维素的溶解度测定方法：取0.5 g微晶纤维素或木聚糖，加至5 g离子液体中90℃下磁力搅拌，若完全溶解，再加0.5 g微晶纤维素或木聚糖，12 h内累计微晶纤维素或木聚糖添加量为其纤维素或半纤维素溶解度。

1.2.2 玉米秸秆离子液体预处理 将风干后的物料粉碎并筛选40～60目颗粒备用。取2.5 g物料和50 g离子液体置于250 mL耐压瓶中，130℃烘箱中放置1.5 h，取出，冷却至室温后，向体系中缓慢加入100 mL去离子水，离心、沉淀洗涤至上清液无色，置于50℃烘箱中烘干备用[15]。所有试验平行3组。

式（1）中，A为回收率；A0为原样品质量；A1为预处理后样品质量。

1.2.3 离子液体预处理前后纤维素酶酶解 分别取1 g预处理前后的样品，加入适量的纤维素酶（25 FPU/g）和pH值为4.8的0.05 moL/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，50℃、100 r/min条件下进行酶解糖化反应，定时取样，沸水灭活，过0.45 μm水系膜，采用高效液相法（HPLC）测定水解液中葡萄糖含量。

式（2）中，B为酶解效率；B1为酶解产生的葡萄糖量；B1为材料所含纤维素量。

1.3 分析方法

1.3.1 成分分析 玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素含量的分析参照美国能源部可再生能源实验室（NREL）的方法进行测定[18]。

1.3.2 扫描电子显微镜（SEM）分析 玉米秸秆固定在样品台上，离子溅射仪溅射喷金，然后在日立 S-4800场发射扫描电子显微镜（日本日立株式会社）下观察纤维素的形态。

1.3.3 X-ray衍射分析 预处理前后玉米秸秆的X-衍射结晶度通过D8 Advance型X-衍射分析仪（德国 Bruker AXS公司）测得。扫描范围 10°～40°，扫描速度2°/min，扫描电压与电流分别为40 kV、40 mA。

1.3.4 热重分析 采用梅特勒-托利多仪器有限公司TGA/SDTA851e热重分析仪来测定预处理前后秸秆样品的热稳定性，分别将5 mg左右预处理前后的秸秆材料置于坩埚容器内，在N2保护下，以15℃/min的加热速率从25℃升温至500℃，记录样品质量随温度变化的关系曲线。

1.3.5 傅里叶红外光谱（FT-IR）分析 取预处理前后的样品以1∶100比例同溴化钾混匀后，研磨至约300目粉末，压片，利用Nicolet iS10型傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Scientific公司），扫描波长范围是 4000～400 cm-1，分辨率是 2 cm-1，扫描32次，空气为背景。

2 结果与讨论

2.1 秸秆主要组分在离子液体中的溶解度

要选择出处理效果较好的离子液体，需要考虑3方面因素：1）离子液体对木质素、纤维素和半纤维素的溶解度；2）离子液体从原料中选择性提取木质素的能力；3）预处理后物料的酶解效率[19]。木质素与半纤维素通过共价键结合形成致密网状结构包裹着纤维素，因此，需要离子液体对各组分有一定的溶解度并能打破木质素与半纤维素之间的共价键才能有效地将木质素提取出来增加纤维素酶与底物的可及性从而提高酶解效率[20]。由表1可知，[Emim]Ac和 [Amim]Cl对木质纤维素各组分都有较好的溶解效果，[Bmim]HSO4对木质素和半纤维素有较好的选择性溶解效果，而[Bmim]BF4对木质纤维素各组分都基本不溶。

2.2 离子液体预处理前后秸秆的成分分析和酶解效率

结合表1和表2可以看出，木质素的去除可以有效地提高物料的酶解效率。[Emim]Ac和[Amim]Cl对木质纤维素各组分都有较高的溶解度，其木质素去除效果也较好，预处理后物料的酶解效率也较高。另外，[Emim]Ac具有较好的选择性去除木质素的效果，即在预处理过程中保留了可以被酶解的纤维素和半纤维素，除去了阻碍底物酶解的木质素，保证底物的物料得率，节约资源降低成本。

[Bmim]HSO4对木质素和半纤维素溶解效果较好，但其木质素去除效果并不理想，其酶解效率也较低。[Bmim]BF4对木质纤维素的各个组分溶解效果并不理想，但预处理后去除木质素的能力大于[Bmim]HSO4，酶解效率与[Amim]Cl预处理后物料的酶解效率相当。为了进一步研究预处理对物料酶解效率的影响因素，对预处前后物料的理化性质进行分析。

表1 碱木质素、微晶纤维素和木聚糖在离子液体中的溶解度Table1 Solubility of lignocellulose constituents in ionic liquid

表2 离子液体预处理前后秸秆成分分析和酶解效率（±s）Table2 Constituents of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquid（±s）%

表2 离子液体预处理前后秸秆成分分析和酶解效率（±s）Table2 Constituents of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquid（±s）%

注：酶解条件：1 g样品，25 FPU/g纤维素酶，50 mmoL/L缓冲液（pH 4.8），酶解体系为 100 mL，50℃，100 r/min，酶解时间为 12 h；同列不同小写字母表示不同处理之间在0.05水平存在显著差异

离子液体回收率纤维素15.79±0.45 d半纤维素木质素10 0.00±0.00 a 原材料15.77±0.45 b 30.89±0.30 a 24.27±0.35 a 76.61±0.56 c [E m i m]A c 28.01±0.30 b 11.02±0.45 d 91.20±0.25 a[A m i m]C l 18.47±0.50 d 68.42±0.43 d 16.60±0.43 a 13.75±0.38 c 28.37±0.34 c[B m i m]H S O 4[B m i m]B F 4 75.30±0.55 c 25.37±0.51 c 10.29±0.42 e 10.11±0.21 e 16.25±0.19 b 12.41±0.53 e 79.24±0.29 b 28.91±0.89 b 11.58±0.28 d酶解效率12.93±0.28 c 29.49±0.25 b

2.3 离子液体预处理前后玉米秸秆物理化学结构分析

2.3.1 扫描电子显微镜（SEM）分析 从图1可看出，未经预处理的木质纤维素结构平滑致密，与纤维素酶接触位点有限，酶解效果比较差，预处理后的木质纤维素表面发生较大变化，致密平滑的结构被破坏，变得疏松多孔，这可能是由于除去了木质素、半纤维素和无定型纤维素导致的，疏松的结构为纤维素酶提供较多的接触位点，木质素的去除减少了纤维素酶的无效吸附，因此预处理后木质纤维素的酶解效率较原材料高。其中，相比于其他3种离子液体，[Emim]Ac预处理后物料最为疏松多孔，纤维素酶更易进入物料内部与底物接触，预处理后物料的酶解效率较其他3种离子液体高。

图1 离子液体预处理前后秸秆电镜图（×1200）Fig．1 SEM imagines of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquids（×1200）

2.3.2 X-ray衍射分析 由图2可以看出，预处理前2θ=15.26°、22.54°的峰为纤维素晶型 I的出峰位置，[Emim]Ac预处理后2θ=15.26°处的峰消失，在 2θ=22.1°处有峰，说明预处理后纤维素发生了晶型的转变，由晶型I转变为更易被酶解的晶型II[21]，因此[Emim]Ac预处理过后的秸秆由于结晶型纤维素转变为更易被酶解的无定型纤维素从而酶解效率提高至91.20%，SAMAYAMIP等[22]通过实验也说明了晶型的转变有利于酶解。相对于[Emim]Ac的预处理效果，其他3种离子液体在130℃、1.5 h处理条件下并没有改变纤维素的晶型，且2θ=22.54°处的峰较原材料更尖锐，许多研究者在木质纤维素预处理过程中发现了类似的现象，这是由于预处理除去了原材料中无定型纤维素而导致其相对结晶度增大。

2.3.3 热重分析 生物质中不同组分的热稳定性差异很大，其中，纤维素和木质素含量是生物质热稳定性的重要影响因素[23]。不同离子液体预处理后秸秆的热稳定性如图3所示。从图3中可以看出，预处理前后秸秆的主要降解温度为200～400℃，未经处理的秸秆在348℃时质量百分比降至50%，而[Emim]Ac、[Amim]Cl、[Bmim]HSO4预处理过后的秸秆分别在270、329、330℃降至初始质量的50%，这是由于预处理过程中离子液体进入到物料内部导致秸秆疏松多孔，因此预处理后物料热稳定性有所下降。其中，[Emim]Ac预处理后的秸秆热稳定性最差，是由于[Emim]Ac预处理过程中纤维素由结晶纤维素转变为无定性纤维素从而导致样品易被热降解。[Bmim]BF4处理后的样品则在352℃质量百分比降至50%，与预处理前物料相当，是由于[Bmim]BF4对木质纤维素各个组分溶解能力较差而无法渗透至物料内部形成疏松多孔结构。

图2 离子液体预处理前后秸秆的XRD谱图Fig．2 XRD imagines of corn stalk before and after pretreatment by ionic liquids

图3 离子液体预处理前后秸秆热重分析曲线Fig．3 Thermogravimetric analysis of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquids

当温度加热至500℃时，预处理前后的秸秆均有少量残余物，是在N2环境中产生的富碳化合物[24]，但可以明显的看到预处理后样品残余物量低于原材料，是由于离子液体预处理去除了部分木质素和灰分，因此残余物量较少[25]。

2.3.4 FT-IR分析 由预处理前后物料的FT-IR图4可以看出，预处理后木质素芳环骨架的特征吸收峰1512 cm-1明显减弱，这表明在预处理过程中木质素被脱除或被破坏[26]。[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac预处理后半纤维素中的羰基C=O伸缩振动1732 cm-1基本消失，木质素和半纤维素之间CO伸缩振动信号峰1249 cm-1强度减弱，说明预处理打破了半纤维素和木质素之间的连接酯键[27]，而[Bmim]HSO4预处理后的木质纤维素在1732 cm-1处的信号峰只是有所减弱并没有消失，说明[Bmim]HSO4预处理破坏半纤维素和木质素链接酯键的能力不如[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac，而破坏半纤维素和木质素的能力与预处理后物料的酶解效呈正相关，此结果与表2中酶解效果一致，这与DEMARTINI等[28]在研究细胞壁乙醇发酵过程中得出的结论一致。

图4 离子液体预处理前后秸秆的FT-IR谱图Fig．4 FT-IR imagines of corn stalks before and after pretreatment by different ionic liquids

3 结语

实验结果表明，[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac预处理都可提高秸秆的酶解效率。其中，[Emim]Ac预处理可以选择性地去除木质素，减少纤维素酶的无效吸附；打破木质素和半纤维素之间的共价键，破坏包裹着纤维素的紧密的网状结构使纤维素暴露；处理后秸秆中结晶纤维素转化为更易被酶解的无定型纤维素，大幅度提高了纤维素的酶解效率。这些预处理后理化性质的改变有效地提高了玉米秸秆的酶解效率，相比于原材料提高了4.77倍。