血小板内皮细胞黏附分子1和平滑肌蛋白1基因多态性与颈动脉斑块易损性关系的研究

李昊文 沈宓 李子瑞 张文丽 王宇新 高培毅 王雅杰

缺血性卒中发病率和致死率高，是世界范围内威胁人类生命健康的重大疾病。动脉粥样硬化易损斑块破裂引发的血栓栓塞是缺血性卒中的主要致病因素。颅外段颈动脉或颅内动脉粥样硬化斑块均可以导致供血动脉管腔狭窄、血栓形成甚至栓子脱落，从而引发缺血性卒中[1-2]。组织病理学研究结果显示，易损斑块的特点包括管腔表面破裂、斑块内出血、附壁血栓等[3-4]。早期准确识别和评估可能导致缺血事件的易损斑块对于指导临床治疗及卒中预防至关重要。目前迫切需要发掘有效的生物标志物来区分易损型和稳定型动脉粥样硬化斑块患者[5]。

单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism，SNP)指基因组上单个核苷酸变异所形成的遗传标记，人类许多表型差异、对药物或疾病的易感性均与SNP相关。全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)在全基因组水平通过对大量样本进行SNP等遗传标记的分型分析，从而寻找与复杂疾病相关的遗传基因。已有多项GWAS发现了众多与动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性疾病、心肌梗死相关的SNP位点[6-8]，其中一些位点位于相关的功能基因内部或附近。近年来，研究发现血小板内皮细胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM1)中SNP位点rs1867624、平滑肌蛋白1(leiomodin 1，LMOD1)中SNP位点rs2820315可能与动脉粥样硬化及主动脉疾病相关[7]，但其与动脉粥样硬化斑块易损程度的研究报道较少。

本研究通过对具有颈动脉斑块的缺血性卒中患者PECAM1基因SNP位点rs1867624和LMOD1基因SNP位点rs2820315进行基因分型，研究PECAM1、MOD1基因多态性与缺血性卒中患者颈动脉斑块易损风险的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

前瞻性连续纳入自2014年5月至2017年10月期间于北京天坛医院就诊的具有颈动脉斑块的缺血性卒中患者270例，其中男212例，女58例；年龄40～85岁，平均(60±9)岁，40～49岁35例，50～59岁85例，60～69岁120例，70～79岁28例，80～85岁2例；伴有高血压病176例(65.2%)，糖尿病91例(33.7%)，高脂血症87例(32.2%)，短暂性脑缺血发作(TIA)45例(16.7%)，具有卒中史64例(23.7%)，卒中家族史46例(17.0%)，心肌梗死家族史6例(2.2%)。

纳入标准：年龄40～85岁；发生于6个月内；经过临床诊断为前循环、非心源性缺血性卒中患者；高分辨率MRI显示具有颈动脉斑块。缺血性卒中患者的诊断符合1995年全国第四届脑血管病会议通过的卒中诊断标准[9]。

排除标准：心源性卒中(通过超声心动检查及24 h动态心电监测排除)；既往颈动脉手术或支架置入史；既往颈部放射治疗；既往肝、肾病史及肝移植患者。

本研究方案经首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准(审批号：KY2014-004-04)。所有纳入患者已签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1资料收集:收集受试者人口统计学信息(性别、年龄、住址、入组时间等)、卒中危险因素(高血压病、糖尿病、高脂血症、既往TIA或卒中史、吸烟史)。常规体格检查包括身高、体质量、心率、血压(收缩压、舒张压)等，实验室检查包括三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、糖化血红蛋白等。

高血压病定义为在未使用降压药物的情况下，3次非同日测量收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg[10]。糖尿病定义为未使用降糖药物情况下，空腹血糖≥7.0 mmol/L[11]。高脂血症定义为未使用降脂药物情况下，血清中总胆固醇≥6.2 mmol/L和(或)三酰甘油≥2.3 mmol/L[12]。吸烟史定义为患者目前或过去吸烟，吸烟数量≥5支/d或吸烟时间≥2年。

1.2.2影像学检查方法：使用3.0 T超导MR设备(型号Trio-Tim，Siemens公司，德国)对纳入患者进行颈动脉高分辨率MRI检查。颈动脉3D血管成像序列：(1)三维时间飞跃法MR血管成像序列：轴面扫描，重复时间(time of repetition,TR)25 ms，回旋时间(time of echo,TE)4 ms，空间分辨率 0.6 mm×0.8 mm×2.0 mm，视野 160 mm×120 mm，扫描时间 2 min。(2)T1加权可变反转角的三维快速自旋回波序列：冠状面扫描，TR 800 ms，TE 22 ms，空间分辨率 0.8 mm×0.8 mm×0.8 mm，视野180 mm×170 mm，扫描时间261 s。(3)重T1加磁化准备快速梯度回波序列：轴面扫描，TR 8.8 ms，TE 5.3 ms，空间分辨率 0.8 mm×0.8 mm×0.8 mm，视野140 mm×140 mm，扫描时间199 s。颈动脉超声检查采用日本东芝Aplio 500型彩色多普勒超声诊断仪。

1.2.3分组：依据颈动脉高分辨率MRI检查结果，按照斑块性质，将纳入患者分为易损斑块组与稳定斑块组。易损斑块定义为具有斑块内出血和(或)斑块表面缺陷，如纤维帽破裂、溃疡或表面血栓[4, 13]。

1.2.4基因型分析：患者入组后3 d内，清晨6点至10点空腹抽取外周静脉血2 ml，使用血液基因组DNA提取系统(天根生化科技有限公司)提取DNA，方法见试剂盒操作说明书。利用TaqMan探针(Thermo Fisher，美国，探针编号：C_155066_10及C_1467677_10)分别对PECAM1 rs1867624 和LMOD1 rs2820315 SNP位点进行基因分型。反应体系：DNA模板20 ng，TaqMan SNP Genotyping Assays 0.25 μl，2×TaqMan Genotyping Master Mix(Thermo Fisher)5 μl，补水至10 μl。7 500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems，美国)仪器进行基因型检测，反应条件如下：95 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重复40个循环。每个SNP位点每种基因型各取2个样本利用测序的方法进行验证。实时聚合酶链反应方法分型失败的样本利用测序的方法进行分型。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基本资料比较

270例患者中，189例具有易损斑块，81例具有稳定斑块。稳定斑块组及易损斑块组的患者基本临床资料比较见表1。两组患者平均年龄、舒张压差异均有统计学意义(均P<0.05),其他如体质量指数、收缩压、高血压病、糖尿病、高脂血症、TIA史、卒中史、吸烟史、实验室检测指标(三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、糖化血红蛋白等)差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.2 PECAM1基因rs1867624位点及LMOD1基因rs2820315位点多态性与斑块易损性关系

稳定斑块组和易损斑块组患者中，rs1867624和rs2820315位点的基因频率和基因型分布比例均达到Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)。

对PECAM1基因rs1867624位点的多态性分析显示，T/T基因型在易损斑块组患者中所占比例更高，C/C基因型在稳定斑块组患者中所占比例更高。等位基因T是易损性斑块风险基因，其基因频率在易损斑块组中为87.3%(330/378)，在稳定斑块组中为79.6%(129/162)。风险等位基因OR值为1.759(95%CI：1.080～2.864，P=0.022)，见表2。对LMOD1基因SNP位点rs2820315的分析显示，C/C基因型在易损斑块组患者中占更高比例，T/T基因型在稳定斑块组患者中占更高比例。等位基因C是易损性斑块的风险基因，其基因频率在易损斑块组中为87.6%(331/378)，在稳定斑块组中为80.9%(131/162)，其OR值为1.667(95%CI：1.014～2.738，P=0.042)，见表3。

将单因素分析差异有统计学意义的年龄、舒张压与PECAM1基因rs1867624位点和LMOD1基因rs2820315位点风险基因型纳入二分类Logistic回归分析中，结果表明，年龄、rs1867624位点T/T基因型及rs2820315位点C/C基因型是易损斑块发生的危险因素(均P<0.05)，见表4。

3 讨论

近年来，多项GWAS通过高通量测序和DNA微阵列技术，发现了数十个甚至上百个与动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、主动脉疾病相关的基因多态性位点[6-8]。多项独立试验结果证实，其中一些基因的多态性与动脉粥样硬化高度相关，如CDKN2A/2B、ADAMTS7、PHACTR1、SH2B3、COL4A1/2等[6,14-17]。然而，GWAS数据通常有较高的假阳性，并且多项GWAS是基于欧洲人群，基于亚洲人群的研究相对较少。由于人种间基因构成的差异，一些在欧洲人群中发现的动脉粥样硬化易感位点在中国人群中无法直接应用，如东亚人群中9p21.3、SORT1、PDGFD的OR值均小于欧洲人群[6]。因此，在使用来自欧洲人群的GWAS数据前，我们首先需要在中国人群中进行广泛验证。

表1 两组具有颈动脉斑块的缺血性卒中患者一般资料及临床资料比较

组别例数TIA史卒中史吸烟例(%)三酰甘油[M(P25,P75),mmol/L]胆固醇LDL-CHDL-Cx-±s,mmol/L空腹血糖[M(P25,P75),mmol/L]A组8138(46.9)12(14.8)17(21.0)1.21(0.92,1.95)3.9±1.22.4±1.01.0±0.35.55(4.79,7.53)B组18987(46.0)33(17.5)47(24.9)1.51(0.85,1.94)3.8±0.92.2±0.81.0±0.35.30(4.61,6.33)检验值0.018a0.286a0.472a-0.474c0.469b0.958b-0.132b-0.678cP值0.894a0.593a0.492a-0.635a0.641a0.341a-0.895a-0.497a

注：A组为稳定斑块组，B组为易损斑块组；TIA为短暂性脑缺血发作，LDL-C为低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C为高密度脂蛋白胆固醇；a为χ2值，b为t值，c为Z值

表2 具有颈动脉斑块的缺血性卒中患者PECAM1 rs1867624基因多态性与斑块易损性关系

注：PECAM1为血小板内皮细胞黏附分子1，MAF为最小等位基因频率

表3 具有颈动脉斑块的缺血性卒中患者LMOD1 rs2820315基因多态性与斑块易损性关系

注：LMOD1为平滑肌蛋白1，MAF为最小等位基因频率

表4 具有颈动脉斑块的缺血性卒中患者易损斑块风险因素的二分类Logistic回归分析结果

2017年，研究人员通过基因芯片及Meta分析，发现了15个与冠状动脉疾病相关的基因多态性新位点，这些位点位于与动脉粥样硬化及主动脉疾病相关的功能基因附近，如细胞黏附、白细胞迁移和动脉粥样硬化相关的PECAM1基因、与凝血和炎性反应相关的PROCR基因、与血管平滑肌细胞分化相关的LMOD1基因等[7]。PECAM1参与维持血管壁屏障的完整性，血管壁屏障功能损伤可导致动脉粥样硬化等慢性炎性疾病的发生[18]。研究结果证明，表达PECAM1的内皮细胞血管壁屏障完整性恢复更快[19]，此外，PECAM1表达能够增加小鼠动脉粥样硬化易感区域斑块负载并减小主动脉的动脉粥样硬化区域[20-21]。因此，PECAM1作为一种候选基因与主动脉疾病的发生密切相关。LMOD1在动脉血管壁等富含平滑肌的组织中高度表达[22]，敲除LMOD1基因会导致主动脉平滑肌细胞增殖及迁移能力加强、收缩能力受损。研究结果显示，LMOD1在维持平滑肌分化状态中起关键作用[23]。LMOD1基因多态性变化可能导致该基因在平滑肌细胞中的表达或功能紊乱，从而提高主动脉疾病的遗传风险。

rs1867624 SNP位点位于PECAM1基因上游，rs2820315 SNP位点位于LMOD1基因内含子区域。该两个基因多态性位点均处于基因的非编码区域，关于其引起动脉粥样硬化斑块易损性变化的机制尚不明确。推测其可能影响基因表达水平，或者仅作为与疾病关联表达的遗传位点。本研究通过对具有易损斑块和稳定斑块的两组缺血性卒中患者进行基因分型，发现PECAM1基因rs1867624位点T/T基因型，LMOD1基因rs2820315位点C/C基因型在具有易损斑块的患者中所占比例更高；rs1867624位点C/C基因型，rs2820315位T/T基因型在具有稳定斑块的患者中占更高比例。PECAM1基因SNP位点rs1867624等位基因T、LMOD1基因SNP位点rs2820315等位基因C是形成易损性斑块的危险基因。进一步行多因素Logistic回归分析结果显示， rs1867624位点T/T基因型和rs2820315位点C/C基因型是形成易损性斑块的风险因素，表明PECAM1、LMOD1基因多态性与缺血性卒中患者颈动脉斑块易损风险相关，但这些基因多态性的具体功能和作用机制还需要进一步研究。

本研究入组6个月内发生缺血性卒中的患者，其中一些患者由于治疗，颈动脉斑块的性质可能会发生逆转(由易损斑块变成稳定斑块，斑块体积变小等)。大量临床研究证实，他汀类药物具有调节脂代谢、稳定动脉粥样硬化斑块的作用。常规他汀类药物治疗剂量能起到调脂、稳定动脉粥样硬化斑块、延缓斑块进展的作用，大剂量他汀类药物可能使部分患者有机会发生斑块逆转，如应用辛伐他汀每天40 mg或阿托伐他汀钙每天80 mg治疗[24-25]。但并不是所有大剂量服用他汀类药物的患者均能发生斑块逆转，不同人的药物反应存在差异。并且，由于大剂量药物使不良反应增加，临床上很少长时间大剂量使用他汀类药物。另外，斑块逆转是一个较为漫长的进程，至少会持续1年以上，相关临床研究多在1～3年。因此本研究入组标准6个月内，由于治疗发生斑块逆转的机会不高，对试验结果造成的偏倚很小。

本研究的局限性在于：(1)由于动脉粥样硬化是全身性、系统性疾病，患者脑血管、冠状动脉、主动脉等也可能存在狭窄和易损斑块，本研究未对除颈动脉以外的其他部位血管进行评价，因此PECAM1、LMOD1基因多态性与其他部位动脉粥样硬化斑块易损性的关系尚需进一步研究。(2)由于入组条件比较严格(患者患有缺血性卒中，具有颈动脉斑块，且经过高分辨MRI及B超检查)，入组的患者数量相对较少。大样本量使我们能够找到疾病相关的微效基因，但这些微效基因往往无显著的临床意义。在本研究中，由于样本量较小，更容易寻找到与真实的临床疾病相关性强的关键基因。我们计划未来继续收集临床患者，丰富试验样本库，对研究结果进行验证和完善，并发掘更多有意义的与缺血性卒中及动脉粥样硬化斑块稳定性相关的SNP位点。