基于HPLC-ELSD和偏最小二乘判别分析法的蜂蜜掺假鉴别

许艳超， 陈尚卫， 朱 松， 季福标， 戴 军*

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；3.江苏日高蜂产品有限公司，江苏 淮安 211799）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经过在巢脾内转化、脱水、贮存至成熟的过程而酿成的天然甜物质[1]。蜂蜜作为天然物质，具有独特的风味、口感和营养价值，并要求蜂蜜中不得添加或混入任何淀粉类、糖类、代糖类物质[2]。蜂蜜掺假不仅降低了蜂蜜的营养价值，还极大地损害了正规蜂农及企业的利益，破坏了市场秩序。蜂蜜掺假多使用价格低廉且外观特性与蜂蜜极为相似的果葡糖浆、蔗糖或者麦芽糖浆[3]，目前报道了多种掺假检测技术。例如A.I.Ruiz-Matute等人用GC（气相色谱）和GC-MS（气相色谱质谱法）检测蜂蜜中是否含有二果糖酸酐（DFAs）来判定是否掺假[4-6]，Megherb等人首先将样品进行反相固相萃取，去除单糖和部分寡糖，同时对多糖进行浓缩，通过使用HPAEC-PAD（高效阴离子交换色谱）检测样品中的聚合度为11-17的多糖构成指纹图谱来鉴别样品中是否掺有玉米糖浆，最低可检测到的掺假量为1%[7]，李水芳等利用拉曼光谱结合PLS-LDA（偏最小二乘-线性判别分析）对蜂蜜中果葡糖浆和麦芽糖浆掺假进行研究，结果对果葡糖浆和麦芽糖浆混合物、果葡糖浆、麦芽糖浆的准确识别率分别达到 75.6%、91.1%、97.8%[8]，Davide Bertelli等人利用1D和2DNMR（核磁共振）测定蜂蜜中物质成分差异，并结合统计学分析方法鉴定样品真假[9]，Murat Tosund等人通过13C/12C同位素比率分析法可检测出掺有5%以上麦芽糖浆的掺假蜂蜜[10，15]。

作者利用HILIC（亲水作用色谱）柱分离低聚糖异构体的优势[11]，通过检测灵敏度比示差折光高且与梯度洗脱兼容的蒸发光散射检测器（ELSD）[11-14]对蜂蜜中的糖类物质进行分离测定，并根据纯真蜂蜜和掺假所用糖浆的组成及其色谱峰差异，结合统计学分析方法[9，16-21]对真假样品进行分类来判定蜂蜜掺假，从而建立了一种较通用、易推广的新的蜂蜜掺假检测方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料 分别采集了江苏、河北、山东、辽宁等地的蜂蜜，主要为洋槐、枣花、油菜、荆条、椴树等9种单植物源蜂蜜，共33个样品。样品采集后按GB/T 23194-2008（蜂蜜中植物花粉的测定方法）确定蜂蜜的蜜源以及真实性；果葡糖浆、麦芽糖浆，均购自于市场。

1.1.2 试剂 葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖标准品，Sigma公司产品。

1.1.3 仪器 Agilent 1100系列高效液相色谱仪，Agilent公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理与掺假蜂蜜样品的制备 采集常见的33个纯真的单一花种蜂蜜，分别为油菜蜜、洋槐蜜、荔枝蜜、龙眼蜜、枇杷蜜、枣花蜜、椴树蜜、苕子蜜，用这些真蜂蜜按质量分数10%～30%（梯度10%）加入果葡糖浆模拟配置一个掺假蜂蜜样品集，样品数为 99个（33×3=99）；选择 15个上述真蜂蜜按质量分数5%～10%（梯度5%）加入麦芽糖浆配置一个掺假蜂蜜样品集，样品数为30个，真蜂蜜样品33个，样品集总数为162个。

称取1.00 g样品于25 mL容量瓶内，蒸馏水定容至刻度，充分混匀后，取1 mL过0.45 μm滤膜，滤液于液相进样瓶中备用。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为XBridgeTMD；流动相：A（体积分数50%乙腈）-B（体积分数75%乙腈）二元梯度洗脱。梯度程序：0～20 min，体积分数0%～50%A；20～30 min，50%A；30～33 min，50%～0%A；33～35 min，0%A（100%B）。柱温：35 ℃；流量：1.0 mL/min；进样量：10 μL。 检测器（ELSD）参数：漂移管温度，95℃；氮气流量，2.5 mL/min。

1.2.3 数据处理及模型建立 对色谱图中除单糖外的其他色谱峰进行积分，求得每个峰面积百分比，为增加样品间的差异，以每个峰的峰面积百分比与共有峰的第6个峰的峰面积百分比的比值为新变量，采用偏最小二乘-判别分析方法进行数据分析，该分析过程使用的是SIMCA-P11软件。为了验证分类的稳定性，将样品集分为训练集和验证集。验证集是随机从各个梯度掺假量样品中选取的16个，训练集为其余146个样品。通过相关系数R2和交叉验证回归系数Q2对PLS-DA模型有效性进行评价[17]。

2 结果与讨论

2.1 真蜂蜜与模拟掺假蜂蜜的色谱峰特征及差异

图1为一个真洋槐蜜的色谱图。根据与标准样品色谱图对比（如图2）可知，洋槐蜜在保留时间为10.644 min的色谱峰与蔗糖出峰时间接近（偏后），而洋槐蜜最后一个峰的保留时间为16.195 min的色谱峰与麦芽三糖出峰时间相近（偏前），因此洋槐蜜在保留时间为10.644、11.209、11.869、12.382、12.878、13.464、14.169 min处的色谱峰可能均为二糖及其异构体，而保留时间为16.195 min的色谱峰则可能是三糖。将真洋槐蜜与掺有不同比例的果葡糖浆及麦芽糖浆的洋槐蜜色谱图分别进行对比（图3和图4）可见，纯真洋槐蜜与掺假洋槐蜜的差异主要集中在10～15 min之间。图3显示，随着果葡糖浆掺入量的增加，10～13 min的色谱峰高逐渐减小，说明该时间段，以蜂蜜成分峰为主；而13～15 min的色谱峰高随着果葡糖浆掺入量的增加而增加，这表明该时间段以果葡糖浆成分峰为主。同样，由图4可见，随着麦芽糖浆掺入量的增加，模拟掺假样的10～12 min和13～15 min的色谱峰的峰高逐渐减小，即这两时间段内，亦以蜂蜜成分峰为主；而12～13 min的色谱峰高则随着麦芽糖浆掺入量的增加而增加，也说明这些色谱峰以麦芽糖浆及其异构体为主。

图3 真洋槐蜜与掺质量分数10%、20%、30%果葡糖浆洋槐蜜对比图Fig.3 Graph of the sugar profile for 10%，20%and 30%of added fructose corn syrup compared to

图4 真洋槐蜜与掺质量分数5%、10%麦芽糖浆洋槐蜜对比图Fig.4 Graph of the sugar profile for 5%，10%of added malt syrup compared to pure honey

为了定量地表征上述纯真蜂蜜和掺假蜂蜜的色谱峰特征及其差异，从而有效地鉴别掺假蜂蜜，以下应用偏最小二乘法将样品的所有色谱峰的面积与保留时间为14.169 min（图1）的共有峰面积之比作为变量，进行统计学分析。

2.2 真蜂蜜与假蜂蜜的判别分析

偏最小二乘法集主成分分析、多元回归分析和典型相关分析的基本功能为一体，是一种多元统计方法，分析过程中可以对自变量进行信息整合，消除众多信息中相互重叠的部分，使得分析数据更加准确可靠[18]。通过对比，当主成分数增加至2时，交叉有效性的值为0.0295小于临界值0.097，对提示模型的预测精度的贡献不显著，但为了能够绘制出二位成分图，所以依然选择2个主成分t1，t2，不同主成分数建模的有关统计结果如表1，图5为蜂蜜掺假分类的主成分得分3D图，其中黑色的代表所有真蜂蜜，红色的代表掺有果葡糖浆的蜂蜜。图中黑色标记和红色标记的样品没有交叉，因此，该模型能够对样品进行很好的分类。

表1 PLS-DA模型的精度分析Table1 Precision analysis of PLS-DA model

图5 所有蜂蜜掺假分类的主成分得分3D图Fig.5 PLS-DA 3D score plot of honey classification model

2.3 PLS-DA模型的分析

对模型进行20次的置换检验实验，图6为PLS-DA模型置换检验图。在图中，Q2为累积交叉有效性，Q2值与模型的预测能力成正比关系，R2累计方差值，表示用于建立新的PLS-DA判别模型原始数据量的多少，R2值越大则表示模型的解释能力也越强[18]。通过检验图6可以看出，所有位于左边的R2和Q2值（Y轴数据）均低于最右边的R2和Q2值，且Q2回归线的截距均为负值，说明PLS-DA判别模型没有出现过拟合的现象，且有较好的预测能力。

图6 PLS-DA模型置换验证图Fig.6 Permutation Validation of the PLS-DA model

2.4 PLS-DA模型对样品分类验证结果

通过分类列表来评估模型的分类能力。对每一个样品的判定标准为：①若Y＞0.5，且偏差＜0.5时，判定样本属于该类，②若Y＜0.5，偏差＜0.5时，判定不属于该类，③若Y≥0.5，判定不稳定[19]，部分样品判定结果如表2。训练集中的判别率为94.02%，验证集的预测识别率为100%，因此，可得出PLS-DA模型对蜂蜜掺假鉴别效果较好。

表2 部分样品分类结果列表Table2 Classification List Reprojected onto the PLS-DA Model Performed by Considering partical Training Set Samples

续表2

在建模过程中，可采用主成分分析得到的一个衡量样本到主成分空间原点距离的 Hotelling T2统计量来评估被监测样品色谱的离散程度，可以判断出变量对模型的影响[19]。从图7中可以看出，验证集中的变量都在临界值以内（绿色线以下），说明所有的验证集变量符合训练集所构建的空间模型。

3 结 语

提出了一种应用高效液相色谱技术并结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对蜂蜜掺假进行鉴别的方法，通过测定不同地区采集的不同种蜂蜜及其模拟掺假样品的液相色谱图，提取色谱峰型稳定的8个共有特征组分，以训练集样品进行建模，以PLS-DA模型对16个验证集样品预测，正确识别率为100%。实验结果表明，HPLC-ELSD与PLS-DA识别分析相结合，能成功的鉴别出果葡糖浆掺入量在质量分数10%以上、麦芽糖浆掺入量为质量分数5%以上的掺假蜂蜜样品。该方法简便准确，所需仪器较常见，对C3或C4植物源的果葡糖浆和麦芽糖浆的掺假鉴别均适用，具有较好的应用价值。