复合酶法提取苹果渣中的果胶及产品性质分析

王艳翠， 卢韵朵， 史吉平， 刘 莉， 李保国*

（1．上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093；2．中国科学院 上海高等研究院，上海 201210）

目前中国已成为世界上最大的苹果浓缩汁生产国及出口国[1]，每年因生产苹果浓缩汁可排出约150万吨苹果渣[2]，但大部分果品加工厂的果渣都未得到合理利用，主要作为饲料或丢弃，造成资源浪费和环境污染[3]。在食品行业中，果胶广泛应用作乳化剂、增稠剂、凝胶剂、稳定剂等，除此，在纺织、造纸、化妆品等行业也都有所发展[4-5]。在全世界每年果胶的消耗量达3万多吨，且需求量每年增长4%～5%，而我国的果胶产品不仅产量低且质量不高，相比于国外的果胶产品严重缺乏竞争力[6]。苹果渣富含果胶，可作为制备果胶的原材料[7]，从其中提取果胶，具有良好的经济效益和社会效益[3]。目前，工业生产常用酸法提取果胶，果胶提取率低，环境污染较大[8]。

酶法提取果胶是利用酶分解植物组织细胞壁中的纤维素、半纤维素、蛋白质，从而破坏细胞壁结构，减少溶剂提取时来自细胞壁和细胞间质的阻力，将果胶释放溶于水中。有研究表明，采用单一酶法[9-10]，如纤维素酶、半纤维素酶能够提高果胶得率。有研究报道不同种类的酶[8，11-13]从其他原材料如向日葵、柑橘皮中相复合提果胶产品，且实验效果也优于单一的酶法提取，但几种酶协同作用从苹果渣中提取果胶却鲜有研究报道。

作者以苹果渣作原材料，通过复合酶法提取果胶，并结合响应面实验进行优化提取工艺[14]，以期探索提高果胶产量和质量的新工艺，提高苹果渣的综合利用价值，解决环境污染问题，为酶法提取苹果渣果胶的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果渣：市售苹果榨汁后果渣烘干、粉碎；无水乙醇、半乳糖醛酸（AR）：国药集团化学试剂有限公司产品；咔唑（AR）：生工生物有限公司；纤维素酶：上海尤特尔生化有限公司产品；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰酶：南宁庞博生物有限公司产品；木聚糖酶、淀粉酶：白银赛诺生物科技公司产品。

1.2 仪器与设备

水浴恒温振荡器、ZRD-5211鼓风干燥箱：上海智城公司产品；冷冻离心机：日立仪器有限公司产品；H1全功能微孔板检测仪：美国伯腾仪器有限公司产品；CBM-20A高效液相色谱仪：日本岛津有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 传统酸法提取果胶 称4 g苹果渣置于三角瓶中，按固液质量体积比1 g∶15 mL加盐酸溶液，调节体系的pH值为1.5。放置恒温水浴摇床中，温度90℃，转速180 r/min，提取2 h。提取结束定容至100 mL，取30 mL溶液15000 r/min离心15 min。移取20 mL上清液，加入60 mL无水乙醇，使乙醇终体积分数为75%，室温沉淀1 h，过滤，固体烘干，计算粗果胶得率。

1.3.2 果胶的酶法提取 称4 g苹果渣置于三角瓶中，按固液质量体积比1 g∶15 mL加蒸馏水60 mL，调节体系的pH值为酶的最适pH值，分别添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶。放置恒温水浴摇床中，温度50℃，转速180 r/min，提取3 h，煮沸5 min灭酶活。提取结束后定容至100 mL，取30 mL溶液15000 r/min离心15 min。移取20 mL上清液，加入60 mL无水乙醇，使乙醇终体积分数为75%，室温沉淀1 h，过滤，固体烘干，计算粗果胶得率，考察不同酶及其用量对果胶得率的影响。

1.3.3 酶法提取果胶的响应面优化 采用四因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）实验设计，以pH 值（A）、温度（B）、时间（C）、固液质量体积比（D）为自变量，以粗果胶得率为响应值，优化最佳酶法提取果胶的条件。实验设计见表1。

1.3.4 粗果胶得率 将醇沉过滤后的沉淀物放入105℃烘箱，烘干至恒重，冷却后称量，计算粗果胶得率。

式中：x为粗果胶得率，%；m0为烘干后果胶沉淀质量，g；V为果胶提取液总体积，mL；v为用于醇沉的果胶上清液体积，mL；m1为实验样品中苹果渣的质量，g。

表1 响应面分析因素水平设计Table1 Factors and levels in response surface analysis

1.3.5 果胶性质分析 将提取得到的果胶复溶于水中，形成均匀的溶液，用于以下性质分析：

1）果胶中半乳糖醛酸含量的测定 半乳糖醛酸是果胶中的主要成份，其在硫酸溶液中与咔唑试剂反应生成紫红色络合物，该络合物在波长525 nm处有最大吸收。 配制 0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 g/L的半乳糖醛酸标准溶液，分别取1 mL于6支离心管内。加入0.25 mL质量分数为0.15%咔唑乙醇溶液，混匀后迅速加入5 mL质量分数98%浓H2SO4溶液。85℃水浴10 min，冷水浴30 min。在波长525 nm下测定吸光值，并绘制标准曲线，其中横坐标为半乳糖醛酸的浓度，纵坐标为吸光值。

以提取溶剂替代样品溶液作空白对照，测定吸光值，方法同上。公式如下：

式中：X为实验样品中的半乳糖醛酸质量分数，%；c为根据标准曲线得到的半乳糖醛酸质量浓度，g/L；V为果胶提取液的总体积，L；N为提取液的稀释倍数；m为烘干后粗果胶沉淀的质量，g。

2）果胶酯化度的测定[15]取5 mL均匀的果胶溶液，加100 mL水，滴加酚酞。用0.02 mol/L的NaOH滴定，记录消耗的体积V1；加入NaOH（0.5 mol/L）溶液 20 mL，搅拌 15 min后；再加盐酸（0.5 mol/L）标准溶液20 mL，搅拌15 min至粉红色消失后，再滴入酚酞。然后用NaOH（0.02 mol/L）标准溶液滴定至终点（粉红色）。记录滴定的体积V2。计算酯化度DE值。

式中：V1为初滴定值，L；V2为皂化滴定值，L；c1为氢氧化钠浓度mol/L；c3为盐酸的浓度，mol/L；V3为盐酸的体积，mL；c4为氢氧化钠的浓度，mol/L，V4为氢氧化钠的体积，mL。

3）果胶相对分子质量的测定 采用高效液相色谱法对果胶相对分子质量进行测定。色谱条件为：凝胶色谱柱TSK gel Super Multipore PW-H，进样量20μL，流动相H2O，流量0.4 mL/min，柱温35℃，示差折光检测器RID进行检测。相对分子质量分别为12600、110000、289000葡聚糖为标准样，绘制出峰保留时间t与标准样分子量的标曲，果胶样品相对分子质量按照标曲计算。

2 结果与分析

2.1 不同种类酶对果胶提取效果的影响

图1为酶用量为苹果渣质量的5%，固液质量体积比 1 g∶15 mL，温度50℃，反应时间3 h时，酶的种类对粗果胶得率的影响。从图1可以看出：酸法提取中粗果胶得率26.84%；不同种类酶对果胶得率的影响不同，其中添加木聚糖酶的溶液粗果胶得率最高，为35.22%；其次为纤维素酶，达到33.56%；酸性蛋白酶达到32.23%。在后续实验中将此3种酶进行复配用于提取苹果渣中的果胶。

图1 酶的种类对粗果胶得率的影响Fig.1 Effect of enzymes on the yield of crude pectin

2.2 酶用量对果胶提取效果的影响

图2所示不同酶用量（质量分数）下的纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶对苹果渣粗果胶得率的影响，据图2可知，从一定的范围内来看，随着酶使用量的不断增多，明显看到粗果胶得率亦随之增多，待增加到一定的数值之后，酶用量再增加，粗果胶得率不再明显升高，说明此时酶的用量已经趋于达到饱和状态，结合考虑实际成本等因素，最终确定此3种酶的最佳用量（质量分数）分别为：纤维素酶7%、木聚糖酶9%、酸性蛋白酶5%。

图2 酶质量分数对粗果胶得率的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on the yield of crude pectin

2.3 酶法提取果胶响应面优化实验结果与分析

在确定了最优酶的种类及用量基础上，选择自变量为 pH 值（A）、温度（B）、时间值（C）、固液质量体积比（D），响应值为粗果胶得率（Y），采取四因素三水平的响应面实验设计，利用统计软件Design-Expert V8.0.6优化酶法提取果胶的最佳条件。实验方案及结果见表2。

表2 酶解条件响应面实验设计及结果Table2 Designs and results of experiment of enzymatic hydrolysis conditions by response surface methodology

通过Design-Expert.V8.0.6软件对表2中测得的实验结果进行回归方程拟合，得到相应值（Y）与pH 值（A）、温度（B）、时间（C）、液固质量体积比（D）的二次多项回归方程如下：

表3为响应面实验回归模型方差分析结果。从表3的检验结果可知，酶解条件模型p＜0.0001，说明此回归模型极显著；失拟项p值为0.05＜p=0.0621不显著，说明拟合的回归方程情况较好；且该模型复相关系数和校正系数分别为R2=0.9603，R2Adj=0.9206，说明模型的预测值与实测值呈现高度的相关性，分别能解释96.03%和92.06%的响应值变化。离散系数CV较低（0.77），说明实验稳定性高，结果可靠。综上可知该模型拟合较好，酶解提取苹果渣果胶的实验条件可用该模型作进一步的预测和分析。

由表3中P值可知，时间的一次项影响极显著；温度和固液比两个因素的一次项影响显著；pH、温度、时间3个因素的二次项影响极显著。由方差分析表F值知 ：FA=0.57，FB=12.34，FC=147.87，FD=4.53，各因素对粗果胶得率的影响顺序为：C>B>D>A，即时间＞温度＞固液质量体积比＞pH值。

表3 回归模型方差分析表Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial

利用Design-Expert V8.06软件对实验数据进行分析，得到交互作用显著的酶解温度（B）和pH值（A）的响应面图如图3所示，由图3可知，随着酶解温度的升高，粗果胶得率也会随着增大，当酶解温度升高到50℃后，继续提高酶解温度，粗果胶得率下降；随着酶解pH值的增大，粗果胶得率也会随着增大，当酶解pH值增大到4.0后，继续增大酶解pH值，粗果胶得率随着下降。原因可能是随着温度和pH值的增大，超过了复合酶反应的最适温度和pH值范围，影响了酶的活性，进而影响粗果胶得率。因此工业上生产需严格控制反应温度和pH值。

过模型预测得到最佳酶解条件：pH值为4.1，温度为54℃，时间为1.3 h，固液质量体积比为1 g∶16 mL，在该条件下模型预测灵芝粗多糖得率为39.44%。对最优的条件下进行实验验证粗果胶得率为40.66%。因此，通过利用响应面实验优化所得的复合酶法提取粗果胶的参数可供参考。

传统酸法提取果胶，易出现果胶分子水解和降解现象，进而导致果胶得率低、品质受到影响，除此之外，还具有在提取过程中乙醇需求量多、提取液粘度大、耗时长，能耗高等劣势；而酶提法具有提取温度低、提取耗时短，操作条件温和、安全、无污染、减少提取中能量的消耗等优点。将实验取得的研究结果与传统酸法提取苹果渣粗果胶得率为26.84%相比较，提高了51.49%；与卡吉尔公司[16]酶法提取苹果糊果胶得率进行比较，该方法中只使用了Genencor Multifect A40酶，温度 50℃，时间 70 h，粗果胶得率为13.7%。因此，本研究采用复合酶效果提取时间更短，粗果胶得率更高。

图3 各因素交互作用对粗果胶得率的影响Fig.3 Influence of the interaction of the factors on the crude pectin yield

2.4 酶法提取果胶的性质分析

2.4.1 果胶中半乳糖醛酸质量分数及其酯化度从表4可看出，作者用复合酶法提取所得果胶半乳糖醛酸质量分数和酯化度分别为57.39%和89.41%，与传统酸法提取所得果胶半乳糖醛酸质量分数64.48%和酯化度56.08%相比，半乳糖醛酸质量分数略低于传统酸法提取，其可能原因为，由于酶的加入影响了果胶的纯度，后续需对其进行进一步分离提纯处理，目前膜分离技术在果胶提取中的应用研究较多，它可将果胶纯度提高到80%以上[17]。果胶酯化度是影响果胶凝胶时间和凝胶速度的重要因素，亦是评价果胶产品性能的一项重要指标。可分为酯化度大于50%为高酯果胶；酯化度低于50%的为低酯果胶。从酯化度来看，采用复合酶提取和酸法提取得到的果胶均属于高酯果胶，但前者酯化度远高于后者。与邸铮[10]酶法从苹果皮渣提取果胶所得半乳糖醛酸含量和酯化度分别进行比较可知，作者使用复合酶提取所得果胶半乳糖醛酸含量和酯化度均高于单一酶法提取。

表4 果胶中半乳糖醛酸含量及酯化度测定Table4 Determination of galacturonic acid content and the degree of esterification of the pectin

2.4.2 果胶相对分子质量 经过对葡聚糖标准品的测定，得到标准曲线lgMw=-1.0427t+13.574（Mw为葡聚糖标样的相对分子质量；t为标样出峰时间，min；R2=0.9972）

酸法与酶法提取的果胶样品经凝胶柱的相对分子质量分布如图4所示。酸法提取出的果胶样品的相对分子质量主要分布在 165.92×103、5.83×103与0.45×103范围内。酶法提取样品的相对分子质量主要分布在 217.63×103、16.67×103与 8.17×103范围内。

图4 果胶样品的峰图Fig.4 Peak of pectin samples

3 结语

对复合酶法提取苹果渣果胶进行了研究，并对果胶的性质进行了分析。最终得到酶法提取苹果渣果胶的工艺条件为：添加质量分数7%纤维素酶、9%木聚糖酶和5%酸性蛋白酶，酶解条件为pH值4.1，温度54℃，时间1.3 h，固液质量体积比1 g∶16 mL。在此最佳条件下，苹果渣粗果胶得率为40.66%。与传统酸提法粗果胶得率26.84%相比，提高了51.49%。使用复合酶法提取，反应条件温和、无污染、粗果胶得率高；所得果胶半乳糖醛酸质量分数为57.39%，果胶酯化度为89.41%，相对分子质量主要分布在 217.63×103、16.67×103与 8.17×103范围内。与传统酸法和单一酶法提取相比，果胶品质更高，具有更明显的商业价值。