锁阳药材HPLC-ELSD特征指纹图谱的研究

李倩，卫阳飞，黄瑞萍，安琼,*

(1.河西学院医学院中西医结合研究所,甘肃 张掖 734000；2.甘肃省河西走廊特色资源利用省级重点实验,甘肃 张掖 734000)

锁阳,俗称“不老药”,又名绣铁棒、地毛球、沙漠人参等,为锁阳科植物锁阳CynomoriumsongaricumRupr.的干燥肉质茎。锁阳有补肾阳、益精血、润肠通便的功效,用于肾阳不足,精血亏虚,腰膝酸软,阳痿滑精,肠燥便秘等[1]。锁阳广泛分布于甘肃、新疆、内蒙、宁夏、青海等地,其中质量最好的是甘肃河西地区瓜州的锁阳,有“瓜州锁阳甲天下”的美誉,特别是锁阳城“三九锁阳”，更是锁阳中的极品,被当地人视为珍宝,人称“三九锁阳赛人参”[2-4]。

据文献的报道,对锁阳药材的研究，主要探讨了化学成分[5]、提取工艺[6-7]、药理活性[8-9],用特征指纹图谱系统控制锁阳药材质量研究较少，除了刘晔玮等，建立锁阳药材不同产区高效液相色谱二极管阵列检测器(HPLC-DAD)指纹图谱，针对甘肃河西道地药材锁阳特征指纹图谱的研究尚未见到报道。

锁阳药材中含有鞣酸、黄酮、三萜、酸性多糖、甾体、木脂素和生物碱等多种成分。常艳旭等研究者认为儿茶素可作为锁阳活性成分黄酮类的代表，熊果酸可作为活性成分三萜类的代表[10-11]。对其指标性成分的含量测定，紫外检测器的方法较多[12]。但熊果酸结构中无共轭结构和强的生色团，用紫外检测器测定末端吸收干扰较大[13]。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型检测器，它可以对末端吸收弱、没有生色团的物质均产生响应。对于中药材，根据指标成分的特点构建与之相适应的分析方法，可有效表征锁阳药材化学成分,对其评价其质量和真伪具有重要意义。

本文根据熊果酸的结构特点，探索了用HPLC-ELSD法测定锁阳药材三萜类代表的指标性成分熊果酸，分析了不同产地不同批次甘肃河西道地锁阳药材，建立了甘肃河西道地锁阳药材HPLC-ELSD特征指纹图谱并对不同产区的药材质量进行了评价。通过聚类分析，对不同批次锁阳药材的起源进行了识别，为甘肃河西道地锁阳药材质量控制提供了新方法。

1 材料与方法

1.1 药材及试剂

1.1.1 药材

锁阳药材，购自当地的药店。获得的药材由河西学院医学院宋玉霞老师鉴定为为锁阳科植物锁阳CynomoriumsongaricumRupr.的干燥肉质茎(样品信息见表1)。

表1 样品信息表

1.1.2 试剂

熊果酸对照品购自北京世纪奥科生物科技有限公司(批号分别为：1511127 纯度≥98.0%),乙腈(色谱纯，山东禹王试剂厂)，甲醇(色谱纯，山东禹王试剂厂)，乙醇(分析纯，安徽安特生物化学有限公司出品)，冰醋酸(分析纯，上海玻尔化学试剂有限公司)，三氟乙酸(南京国晨化工)，水为重蒸水。

1.2 仪器和色谱条件

1.2.1 仪器

高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器，自动进样阀。KH-3000DB数控型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。十万分之一天平(上海奥豪斯Discovery专业性分析天平)，用于标准品、样品的称量。小型中药粉碎机(久品旗舰店)，粉碎锁阳药材。

1.2.2 色谱条件

Inertsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)为固定相,流动相组成：A为乙腈，B为0.1%的三氟乙酸水溶液；线性梯度洗脱程序见表2，每次进样之前用初始梯度浓度平衡约10 min。柱温室温，流速0.8 mL·min-1，漂移管75℃，气体流速2.0 L·min-1。

表2 梯度洗脱程序(%)

1.3 溶液制备

对照品制备：称取熊果酸的对照品适量用流动相溶解，置成约2.0 mg·mL-1的溶液,用0.22 μm的微孔滤膜过滤，备用。

供试品制备：取10批锁阳药材的样品各自粉碎，过80目筛，称取约1.0 g，精密称定。置于100 mL锥形瓶，量取70%乙醇10 mL，在温度60℃，超声频率100 Hz，超声30 min，滤过，滤液浓缩后加入约10 mL流动相, 用0.22 μm的微孔滤膜过滤，按1.2.2项下色谱条件分析。

1.4 实验数据分析

采用国家药典委员会开发的中药色谱特征指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)，生成对照图谱，计算相似度；用SPSS(22.0)软件做聚类分析；用Origin6.0软件做图。

2 结果和讨论

2.1 优化提取条件

锁阳样品，用超声波法提取。首先考察不同类型的提取溶剂(水、甲醇、乙醇和乙醚等)对其活性成分提取的影响。然后系统考察不同温度，不同溶剂，不同溶剂比例，提取次数对起提取的影响，实验采用L9(34)正交试验设计，用极差分析作为结果的评价，选出最佳锁阳药材活性成分的提取方法。实验结果表明温度在60℃，用70%乙醇做溶剂，溶剂量10 mL，提取一次，提取的锁阳样品色谱峰的出峰个数较多。

2.2 优化HPLC-ELSD的色谱条件

2.2.1 流动相组成

先用等度洗脱程序，甲醇-水，甲醇-水(0.05%三氟乙酸)，甲醇-水(0.10%三氟乙酸)，甲醇-水(0.12%三氟乙酸)，乙腈-水(0.05%三氟乙酸)，乙腈-水(0.10%三氟乙酸)，乙腈-水(0.12%三氟乙酸)分别作为流动相，以样品的出峰数目、分离度、峰形作为考察指标选择流动相的组成。结果显示甲醇-水做为流动相锁阳药材的色谱峰的出峰个数较多、有较好的分离度，当在水溶液中加入0.10%三氟乙酸，色谱峰比较对称。于是甲醇-水(0.10%三氟乙酸)作为样品分析的流动相。然后选用梯度洗脱程序，优化梯度洗脱程序，当在1.2.2项下的梯度程序时，锁阳药材的成分分离度较好，出峰较多。

2.2.2 流速

对于流速，虽然随着流速的增加(0.6，0.7，0.8,0.9，1.0 mL·min-1)分析时间缩短。但是，流速大于1.0 mL·min-1时保留时间相近的色谱峰会被掩盖；流速低于0.7 mL·min-1，分析时间延长且色谱峰重叠的较多，出峰个数减少。因此实验选用0.8 mL·min-1流速作为最佳流速。

2.2.3 漂移管的温度

对于蒸发光散射检测器，漂移管的温度是一项重要的影响参数。当漂移管的温度低时，溶剂发挥不完全；漂移管的温度高时，因分析样品中含有挥发性的成分，检测器的响应会下降[14]。在实验的过程中，我们考察了漂移管的温度在(65、70、75、80、85℃)对样品出峰数的影响，当温度低于75℃时，溶剂发挥不完全，温度高于75℃时，因锁阳药材样品中含有的挥发性成分，导致检测器的响应下降，结果二者均使出现在色谱图上的色谱峰个数减少，于是我们选择了75℃作为漂移管的最佳温度。

2.2.4 气体流速

雾化气体的流速对样品的出峰也有重要的影响，流速度太低时，会形成大量微滴，导致色谱峰出现尖峰信号或噪音信号；雾化气流速度太高时，微滴会大量下降，导致信号响应降低流速，我们考察了(1.8、2.0、 2.2 L·min-1)下的实验结果，当雾化气流速度低于2.0 L·min-1时，色谱图上出现尖峰的信号；雾化气流速度高于2.0 L·min-1时，出现在色谱图上的色谱峰个数减少，于是我们选择了2.0 mL·min-1作为气体的流速。

2.3 方法验证

2.3.1 线性关系

取1.3项下制备的对照品溶液适量，用流动相分别稀释成约0.05,0.1,0.2,0.4,0.8 mg·mL-1的溶液，按1.2.2项下优化的色谱条件，测定熊果酸峰面积，以对照品的浓度作为为横坐标(Y)，峰面积作为纵坐标(X)，绘制标准曲线，获得线性回归方程为:Y=5.198 43X+3.978 83，r=0.999 8，实验结果表明在优化的色谱条件下熊果酸在浓度0.05～0.8 mg·mL-1的范围内线性良好。

2.3.2 精密度试验

取标准曲线项下的溶液，在优化的色谱条件下，连续进样6次，记录熊果酸色谱峰的峰面积，计算RSD,RSD为0.95%，结果显示该方法有好的精密度。

2.3.3 稳定性试验

取供试品溶液(批号1)，配制后的0、2、4、6、8、10、12 h分别在优化的色谱条件下进样分析，记录熊果酸色谱峰的峰面积，计算RSD,RSD为1.08%，结果显示锁阳药材样品在12 h内稳定。

2.3.4 重复性试验

取同一批锁阳药材(批号1)5份，每份样品取1 g，精密称定。各自按供试品溶液制备方法处理，按1.2.2项下色谱条件，每个样品连续进样3次，记录熊果酸峰色谱峰的峰面积，计算RSD,RSD为1.01%，结果表明其重复性良好。

2.4 建立不同产地样品HPLC-ELSD特征指纹图谱

2.4.1 特征指纹图谱的建立

特征指纹图谱是一种包含中药材中共有成分的色谱模式[15]，它反映了该药材中起药理活性的主要化学组分，体现了不同批次不同产区样品之间的相似性。在实验的过程中将样品图谱与特征指纹图谱做对照，用相关系数的中位数作为评价的指标，相关系数的中位数的值越大，说明二者越相似，样品可以鉴别为真品且该样品的质量较好。构建特征指纹图谱包括确定共有峰、计算相对保留时间(RRA)和相对峰面积(RPA)。

将制备好的锁阳药材的供试品溶液，在优化的色谱条件分别进样分析，获得10批样品的色谱图。然后将10批样品色谱图的实验数据导入中药色谱特征指纹图谱相似度评价系统，生成对照图谱，根据色谱峰的保留时间和峰面积，确定了12个共有峰做为锁阳药材的共有峰。将熊果酸的对照品(图1)与样品比较，11号为熊果酸的色谱峰重现性良好，作为参照峰(S)。计算10批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积，作为锁阳药材特征指纹图谱的定量表达，结果见表3和表4。RSD低于1.5%，结果显示该法有较好的稳定性和重复性。建立的甘肃河西道地锁阳的特征指纹图谱可以用于其药材真伪的鉴别和质量的评价。

2.4.2 相似度计算

将2.4.1生成的参照图谱图2，与10批药材的样品色谱图比较，计算相关系数的中位数，评价不同批次药材之间的相似似度。甘肃民乐(S1-S3)、甘肃高台(S4-S5)、甘肃瓜州(S6-S8)及甘肃甘州(S9-S10)的样品相似度相关系数中位数分别为0.821 9,0.925 8,0.846 5,0.832 3,0.932 2,0.902 4,0.913 3,0.928 0，0.965 1,0.863 2。参照李丹毅的研究，相似度相关系数的中位数在0.9以上评价为优质药材，0.8～0.9评价为质量一般的药材，低于0.8评价为伪劣药材[16]。结果显示：批号S2,S5,S6,S7,S8,S9为优质药材，批号S1，S3，S4，S10质量一般。10批样品叠加的图谱见图3。

2.4.3 聚类分析

聚类分析是一种判别模式，中药材通过该模式可以判别药材起源的相近性[17]。将10批不同产地的锁阳药材的共有峰的相对峰面积导入统计学软件，做聚类判别。结果如图4，S6、S7、S8样品在聚类图上离的比较远；S1、S2、S3样品在聚类图近于S6-S8的药材，S4、S5、S9、S10离的比较近。S6-S8是瓜州的药材，在地理位置距离民乐、高台、甘州比较远，其它的药材来源属于同一市区的，在距离上比较近。不同批次之间也有一定的差异。实验结果可以区别不同产地不同批次的锁阳药材。

表3 HPLC-ELSD色谱条件各批药材共有峰的相对保留时间

表4 HPLC-ELSD色谱条件各批药材共有峰的相对峰面积

图1 HPLC-ELSD色谱条件下对照品色谱图

图2 HPLC-ELSD色谱条件下10批样品的共有模式图

图3 HPLC-ELSD色谱条件下10批样品色谱图

图4 聚类分析树状图

3 结论

本研究根据锁阳药材指标性成分熊果酸无共轭结构和强的生色团，构建了锁阳药材的HPLC-ELSD特征指纹图谱。对建立的方法进行方法学的考察，结果表明，建立的方法具有好的精密度、重复性和稳定性。结合中药相似度系统评价相似度和聚类分析模式判别的结果，建立的HPLC-ELSD特征指纹图谱方法，可准确的用于不同产区不同批次锁阳药材质量的鉴别和的产地的区分。