小红参对心肌缺血/再灌注损伤NO、氧化应激及线粒体能量代谢的影响*

张光云，童 英，王 礴，陈 普

（云南中医药大学云南省傣医药与彝医药重点实验室，云南 昆明 650500）

心肌缺血/再灌注损伤（Myocardial Ischemia Rreperfusion Injury，MIRI）是严重影响心肌缺血后溶栓治疗效果的重要病理过程，其发生多认为与大量氧自由基、炎症反应、Ca2+超载、线粒体功能障碍、血管内皮损伤等有关。其中氧化应激损伤和氧自由基连锁反应、血管内皮损伤及线粒体能量代谢障碍被认为是导致MIRI二次损伤的关键因素[1-2]。大量研究发现，药物可通过抗氧自由基、增加eNOS活性及其产生的NO含量，改善线粒体能量代谢减轻MIRI，从而发挥保护心肌细胞的作用[3-5]。小红参为茜草科茜草属植物滇茜草（Rubia yunnanensis Diels.）的干燥根及根茎[6]，在云南民间用于治疗胸痹心痛、心悸、高血压、脉管炎等已有上百年的历史。现代药理学研究发现小红参具有抗心肌缺血的作用，主要表现为抗血小板聚集，增强小鼠耐缺氧能力和心肌中ATP含量[7]；增加狗急性心肌缺血的冠脉血流量以减轻心肌的损伤[8]；且抗心肌缺血的活性部位主要在乙酸乙酯提取物中[9]。课题组前期研究已表明小红参乙酸乙酯部位具有缩小心肌梗死面积，降低心电图S-T段抬高，减少心肌损伤标志物CK-MB和cTnI含量的作用（此部分数据正在他刊投稿中）。因此，基于前期研究和氧化应激及心肌线粒体能量代谢障碍在MIRI发生发展中的关键作用，实验通过复制经典MIRI动物模型，观察小红参治疗MIRI的作用机制，为小红参的进一步研究和临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 48只健康Wistar雄性大鼠，SPF级，体质量（280±20）g，购自昆明楚商科技有限公司，许可证号：SCXK（湘）2013-0004，合格证号：0019228。每笼6只饲养，每日光照约12 h，自由饮食、饮水，环境清洁、通风，温度（22±2）℃，湿度 40%～60%。动物饲养和实验均符合《医学实验动物管理实施细则》要求。实验符合云南中医药大学动物伦理委员会的相关规定。动物购买后适应性喂养1周。

1.2 主要试剂及仪器 小红参购自云南绿生药业有限公司（批号：C180634）；复方丹参片（云南白药集团股份有限公司，批号：A14002034125）；检测试剂盒（eNOS、NO、ROS）、T-AOC（A015）检测试剂盒、CAT（A007-1）检测试剂盒、ATP检测试剂盒、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒、超微量ATP酶Na+-K+和Ca2+测试盒均购自南京建成生物工程研究所；组织线粒体分离试剂盒（ZR0246）购自上海朝瑞技术有限公司。BL-420生物信号采集处理系统（成都泰盟科技有限公司）；V-300多功能小动物呼吸机（上海玉研科学仪器有限公司）；ME104E/02电子天平（梅特勒-拖利多仪器（上海）有限公司）；酶标仪（美国Molecular）；微量移液器（eppendorf公司）；低温高速冷冻离心机（Thermo公司）；旋涡混匀器（上海启前）；混合器（江苏省海门市实验仪器有限公司）。

1.3 药物及制备 称取2 kg小红参药材打碎成粉末，以500 g为单位平均分成4份。500 g小红参分别加入8杯、6杯、4杯（500 mL/杯）95%乙醇浸泡30 min后，加热回流提取3次，合并提取液，抽滤，滤液用旋转蒸发仪（t=70℃，r=90）减压回收乙醇，得浓缩液，同种方法乙醇提取剩余3份小红参药材粉末；将滤液用大型分液漏斗分离的乙酸乙酯部分再用旋转蒸发仪减压回收，最后得小红参浓缩液，置于-80℃内冷冻保存，临用时按低、中、高浓度配制，每次灌胃时将药物加热。

1.4 MIRI经典动物模型制备 除假手术组外，其余药物处理组均在麻醉状态下对大鼠进行气管插管和结扎心脏冠状动脉左前降支30 min，当结扎点以下心肌颜色变白，心电图ST段进行性抬高弓背向上0.2 mv以上，QRS宽大畸形，标志结扎成功；120 min后再灌注，当心肌颜色逐渐由白变红，心电图ST段逐渐回落50%以上，T波逐渐恢复，标志再灌注成功。假手术组大鼠只在结扎点穿线不结扎。

1.5 分组及给药 ①筛选正常心电图大鼠，按随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、小红参低、中、高剂量组、复方丹参片组，共计6组，每组8只。②大鼠给药剂量按人体表面积的0.018计算。小红参乙酸乙酯提取物低、中、高剂量组按等效量1∶3∶5计，给药浓度分别为56.7、170、280 mg/kg；复方丹参片组按生药量给予300 mg/kg；假手术组和模型组按1 mL/100 g给药容积灌胃给药，每天1次，连续14 d。

1.6 观察指标

1.6.1 血清中NO、eNOS含量的检测 各组再灌注2 h后，从腹主动脉取血5 mL置于肝素抗凝管中，静置30 min后，以3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，保存于-80℃待测。按照试剂盒说明书检测NO的含量和eNOS的活性。

1.6.2 心肌组织中ROS、ATP、CAT、T-AOC含量的检测取出心脏，使用预冷的生理盐水清洗干净后，在冰上匀浆并配置为10%的心肌组织匀浆液，以3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，保存于-80℃待测。严格按照试剂盒说明书检测心肌组织中ROS、ATP、CAT和T-AOC的含量。

1.6.3 心肌细胞线粒体能量代谢障碍相关指标的检测取200 mg新鲜的心肌组织，使用生理盐水清洗后匀浆、研磨；根据线粒体提取试剂盒严格操作，从大鼠心脏组织中分离出完整、纯化的线粒体；然后采用超微量ATP酶测试盒检测大鼠心肌细胞中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力，使用线粒体跨膜电位检测试剂盒（JC-1）检测大鼠心肌凋亡细胞线粒体膜电位的变化，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析 所有数据采用SPSS17.0软件进行分析，采用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小红参对大鼠血清eNOS活性及NO含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清eNOS的活性及NO的含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，复方丹参片组和小红参各剂量组均能明显升高大鼠血清中eNOS的活性及NO的含量（P＜0.05），结果见表1。

2.2 小红参对氧化应激相关指标的影响 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中ROS的含量明显升高，CAT和T-AOC的含量明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，复方丹参片组和小红参各剂量组均能降低大鼠心肌组织中ROS的含量，升高CAT和T-AOC的水平（P＜0.05），其中以复方丹参片组和小红参中、高剂量组较为显著，见表2。

表1 小红参对大鼠血清eNOS活性及NO含量的影响（±s，n=8）

表1 小红参对大鼠血清eNOS活性及NO含量的影响（±s，n=8）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 给药剂量/（mg·kg-1）eNOS/（Kat·L-1）NO/（μmol·L-1）假手术组 - 232.04±3.91 58.16±2.33模型组 - 75.79±2.27* 25.36±0.93*复方丹参片组 300 251.81±4.28# 54.39±2.62#小红参低剂量组 56.7 132.89±2.82# 31.50±2.70#小红参中剂量组 170 190.96±3.42# 44.05±2.60#小红参高剂量组 280 240.39±1.77# 52.47±5.20#

表2 小红参对大鼠心肌组织中相关氧化指标的影响（±s，n=8）

表2 小红参对大鼠心肌组织中相关氧化指标的影响（±s，n=8）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 给药剂量/（mg·kg-1）ROS T-AOC/（U·mL-1）假手术组 - 8.63±0.27 76.42±1.69模型组 - 4.38±0.22*复方丹参片组 300 8.19±0.26#小红参低剂量组 56.7 4.85±0.4#小红参中剂量组 170 5.47±0.45#143.7±2.62*89.36±2.59#131.33±2.77#122.68±4.08#小红参高剂量组 280 7.64±0.32#108.12±2.88#CAT/（U·mL-1）51.7±1.3 28.7±1.14*47.57±1.11#31.93±1.2#36.87±2.45#45.1±3.79#

2.3 小红参对能量代谢ATP及ATP酶的影响 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 ATP的含量明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，小红参低剂量组在升高Na+-K+-ATP酶时差异无统计学意义，复方丹参片组和其余的小红参各剂量组均能升高大鼠心肌组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 ATP的含量（P＜0.05），见表3。

2.4 小红参对心肌细胞线粒体膜电位的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的心肌细胞线粒体膜电位明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，小红参低剂量组对大鼠心肌细胞线粒体膜电位升高没有统计学意义，复方丹参片组和其余的小红参各剂量组均能明显升高大鼠心肌细胞线粒体膜电位（P＜0.05），见表4。

表3 小红参对心肌组织中能量代谢ATP酶及ATP的影响（±s，n=8）

表3 小红参对心肌组织中能量代谢ATP酶及ATP的影响（±s，n=8）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 给药剂量/（mg·kg-1）ATP/[mol·（g·prot）-1]假手术组 - 6.46±0.26 Na+-K+-ATP酶/[U·（mg·prot）-1]6.79±0.11模型组 -2.36±0.17*复方丹参片组 300 5.44±0.37#小红参低剂量组 56.7 2.72±0.24#小红参中剂量组 170 3.62±0.17#4.55±0.12*6.46±0.09#4.73±0.36 4.91±0.16#小红参高剂量组 280 4.53±0.29#6.14±0.45#Ca2+-ATP酶/[U·（mg·prot）-1]3.81±0.11 2.71±0.15*3.68±0.2#2.97±0.17#3.08±0.13#3.45±0.17#

表4 小红参对心肌细胞线粒体膜电位的影响（±s，n=8）

表4 小红参对心肌细胞线粒体膜电位的影响（±s，n=8）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别给药剂量/（mg·kg-1）正常细胞/%假手术组 - 32.36±1.4模型组 - 12.42±0.37*复方丹参片组 300 30.37±2.23#小红参低剂量组 56.7 14.18±2.14小红参中剂量组 170 25.64±1.87#小红参高剂量组 280 28.39±1.05#

3 讨论

缺血性心脏病为临床上常见的心血管疾病，已成为引起全球人口死亡的第一位因素，随着人口老龄化，发病率越来越高，严重影响人类健康和生活[10]。MIRI是针对心肌缺血区血液再灌注时出现的一类重要病理损伤。心肌缺血后，及时恢复缺血心肌组织的血流，可有效减轻心肌组织的损伤，但再灌注后产生的大量活性氧自由基（ROS）可引起超氧化物自由基、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基等增多，对细胞膜和蛋白造成直接损害，导致心肌细胞发生功能障碍或坏死[11]。过氧化氢酶（CAT）是天然的抗氧化酶，可催化H2O2产生O2和H2O，对机体的氧化/抗氧化平衡起着至关重要的作用。总抗氧化能力（T-AOC）可反映机体内总体的抗氧化水平，其含量可决定机体的抗氧化能力[12]。实验结果发现小红参可降低MIRI大鼠中ROS水平，并提高CAT和T-AOC活性，表明小红参对MIRI大鼠具有较好的抗氧化能力。

一氧化氮合酶（NOS）是产生一氧化氮（NO）的唯一限速酶，其生物活性可分为内皮型NOS（eNOS）、神经元型NOS（nNOS）和诱导型NOS（iNOS）。其中eNOS主要表达于内皮细胞，其催化生成的NO不仅可调节机体的氧化应激和炎症水平，还可激活sGC/cGMP通路，起到降血压和舒张血管的作用[13-14]。研究发现，eNOS基因的高表达可减少心肌缺血/再灌注24 h后的心肌梗死面积，使用eNOS抑制剂干预后，eNOS的心肌保护作用被抑制[15-16]。因此，在MIRI过程中，心肌细胞损害程度与冠状动脉内皮损伤后导致eNOS的表达下降，NO的释放减少密切相关[17]。实验中给予小红参干预后，MIRI大鼠eNOS活性增强，NO的含量也随之升高，表明小红参可通过调节MIRI大鼠体内eNOS和NO水平发挥抗心肌缺血/再灌注损伤的作用。

目前认为MIRI的始动环节可能与能量代谢障碍有关。ATP作为心肌细胞的直接供能物质，在心肌细胞节律性收缩时需要消耗大量的ATP，ATP含量的减少将会导致心肌细胞凋亡或坏死，加剧MIRI[18]。然而，心肌细胞中90%的ATP来源于线粒体，线粒体作为释放能量的场所，其产生的电子通过呼吸链复合体传递，进而产生的线粒体膜电位在呼吸链复合体和O2的参与下，促使线粒体ATP合成酶生成ATP。线粒体膜电位是维持线粒体结构和功能的根本，目前认为线粒体跨膜电位的下降是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件[19]。研究发现在线粒体内膜上存在许多Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶，它们具有维持细胞膜电位的作用。Na+-K+-ATP酶催化ATP分解释放能量的同时，可将3个Na+转出细胞外，又将2个K+转入细胞内，以维持细胞内外化学梯度及电平衡；Ca2+-ATP酶在催化ATP分解释放能量时，Ca2+可逆浓度梯度发生主动跨膜转运，以维持心肌正常的收缩功能。若Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶减少，将会导致钙超载和氧自由基的增加，进一步影响线粒体代谢功能[19]。实验结果表明，小红参干预MIRI模型大鼠后，可提高线粒体能量代谢ATP酶和心肌细胞线粒体的膜电位，表明小红参可调节MIRI大鼠体内的能量代谢以减轻心肌细胞的损伤。

综上所述，小红参对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与升高血清中NO水平、抗氧化及改善线粒体能量代谢有关，这为临床使用小红参防治MIRI提供了药理学依据。