黄芪总苷防治氯胺酮麻醉致幼鼠记忆损伤的作用及其机制研究

杨 飞 钮峥嵘 李瑞轩 徐桂萍

氯胺酮(ketamine，KTM)是常用麻醉类药物，临床多用于婴幼儿麻醉[1，2]。近年来，随着国家计划生育政策的调整，新生儿数量不断增加，临床应用氯胺酮对婴幼儿实施检查和手术麻醉的病例亦不断增加。但有研究表明，氯胺酮在麻醉时可引发神经毒性和记忆损害等不良反应，并可引起认知功能减退[3，4]。因此，氯胺酮对发育中大脑的神经毒性作用越来越引起医学界的广泛重视[5]。

黄芪来源于豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，被《中国药典》2015年版收载，其性微温，味甘，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌之功效[6]。黄芪总苷是黄芪中的主要药效成分，属于皂苷类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗缺血性脑损伤、抗衰老和改善记忆等多种药理作用[7～9]。但有关黄芪总苷对氯胺酮麻醉致幼鼠记忆损伤的防治作用及其机制研究尚未见报道。为此，本研究中以氯胺酮麻醉幼鼠复制记忆损伤模型，研究黄芪总苷对其治疗作用，并探讨其可能的作用机制。

材料与方法

1.实验动物：SD大鼠，50只，清洁级，21日龄幼鼠，雌雄各半，体质量50±2g，由新疆医科大学动物实验中心提供。

2.药物与试剂：黄芪总苷(含量：98%，批号：EY-(USP)-0202，上海远慕生物科技有限公司)，盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒，南京建成生物工程研究所。caspase-3抗体、Bcl-2抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，BCA蛋白测定试剂盒(美国Thermo公司)；ECL发光液和硝酸纤维素膜(美国Millipoer公司)。

3.仪器：Morris水迷宫(上海基尔顿生物科技有限公司)；Nikon ECLIPSE 80i正置显微镜；H1650台式高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；SpectraMax iD5-多功能酶标仪(中国上海美谷分子仪器有限公司)；BT125D型万分之一电子天平(Sartorius公司)；Morris水迷宫及视频分析软件。

4.动物分组及给药：50只SD幼鼠适应性喂养1周后，随机分为5组，即正常对照组、氯胺酮组、氯胺酮+黄芪总苷高剂量(80mg/kg)组，氯胺酮+黄芪总苷中剂量(40mg/kg)组、氯胺酮+黄芪总苷低剂量(20mg/kg)组，每组各10只。氯胺酮组及氯胺酮+黄芪总苷组腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)，空白对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。除正常对照组外，其余各组麻醉至翻正反射消失后，行假手术处理，无菌操作，于上腹部正中线做一长约1.5cm切口，探查腹部5min，关腹，缝合伤口。术后，氯胺酮+黄芪总苷各组分别灌胃相应剂量黄芪总苷，1次/天，连续1周，正常对照组、氯胺酮组灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。

5.学习记忆实验：采用Morris水迷宫，末次给药后，将各组动物禁食不禁水12h，进行定向航行实验和空间探索实验。将各组幼鼠放入水槽自由游泳2min，适应迷宫内、外环境及游泳状态，持续训练3天，2次/天；第4天起，开始定位巡航实验，幼鼠从4个不同的标记点分别入水，记录其自入水到爬上平台所需要的时间(逃避潜伏期)，如果幼鼠在90s内未找到平台，则将其引导至平台休息10s，逃避潜伏期记为90s。定位巡航结束后进行1天的空间探索实验，撤出平台，将幼鼠放入水中自由游泳，记录各鼠首次穿过平台所在象限需要的时间以及在90s内穿过平台的次数。采用Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成数据的采集和处理。

6.血清SOD、MDA水平测定：学习记忆实验结束后，以10%水合氯醛(3.5ml/kg)对各组幼鼠进行麻醉，腹主动脉取血5ml，室温静置2h，4℃下3000r/min离心5min，分离血清，迅速至-80℃冰箱保存，用于检测血清SOD活性及MDA含量。

7.脑组织病理学检查：取血完毕后，立即断头取幼鼠大脑海马组织，一部分置液氮中冻存，另一部分以4%多聚甲醛溶液固定，4℃过夜，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、制成4μm切片，用于苏木精-伊红(HE)染色检测病理变化。

8.Western blot法检测脑组织中Bcl-2、caspase-3蛋白的表达：处死动物后，取冻存海马区脑组织50mg，液氮中研磨，加入组织裂解液裂解后，BCA法进行蛋白定量，加5×上样缓冲液煮沸10min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后经PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，Bcl-2、caspase-3一抗(1∶1000)稀释液室温孵育2h，继以辣根酶标记的二抗(1∶5000)稀释液室温孵育1h，按照ECL试剂盒说明书进行操作，将发光液均匀地滴在PVDF膜上，反应1 min，最后将膜放入暗室压片成像。结果用目的蛋白的灰度值与内参(GAPDH)的灰度值的比值表示，用Image J软件对成像结果进行定量。

结 果

1.黄芪总苷对氯胺酮麻醉致记忆损伤幼鼠脑组织病理形态学影响：正常对照组幼鼠大脑组织海马区神经元细胞密集，数量多，椭圆形或圆形，排列整齐，神经元胞质丰满，核仁明显；氯胺酮组海马区神经元细胞排列疏松，细胞体积缩小，细胞核紧缩，神经元细胞数量较少，提示氯胺酮麻醉可导致幼鼠海马区神经元细胞损伤；氯胺酮+黄芪总苷各剂量组神经细胞排列较为紧密，细胞核仁清晰，数量较多，提示黄芪总苷对氯胺酮导致幼鼠海马区损伤的神经元细胞具有一定的修复作用(图1)。

图1 各组幼鼠脑组织病理形态学比较(HE,×400)A.正常对照组；B.氯胺酮组；C.氯胺酮+黄芪总苷高剂量组；D.氯胺酮+黄芪总苷中剂量组；E.氯胺酮+黄芪总苷低剂量组

2.黄芪总苷对氯胺酮麻醉致幼鼠记忆损伤的影响：定位巡航阶段第1天和第2天，氯胺酮组、氯胺酮+黄芪总苷各剂量组的潜伏期均显著高于正常对照组(P<0.05)，氯胺酮组与氯胺酮+黄芪总苷各剂量组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)，提示氯胺酮麻醉可造成幼鼠记忆损伤。第3天氯胺酮+黄芪总苷各剂量组与正常对照组幼鼠逃避潜伏期比较，差异无统计学意义(P>0.05)，显著低于氯胺酮组(P<0.05)，详见表1。空间探索实验中，氯胺酮组首次穿过平台所在象限需要的时间显著长于正常对照组，穿台次数显著少于正常对照组，氯胺酮+黄芪总苷各剂量组首次穿过平台所在象限需要的时间显著短于氯胺酮组(P<0.05)，穿台次数显著多于氯胺酮组(P<0.05)，详见表2。

3.黄芪总苷对氯胺酮麻醉致幼鼠记忆损伤幼鼠血清SOD、MDA水平的影响：与正常对照组比较，氯胺酮组幼鼠血清SOD活性显著下降，MDA含量显著提升(P<0.05)；与氯胺酮组比较，氯胺酮+黄芪总苷各剂量组幼鼠血清SOD活性显著提升，MDA含量显著降低(P<0.05)，详见表3。

表1 黄芪总苷对氯胺酮麻醉致记忆损伤幼鼠定位巡航实验结果的影响

表2 黄芪总苷对氯胺酮麻醉致记忆损伤幼鼠空间探索实验结果的影响

表3 黄芪总苷对氯胺酮麻醉致幼鼠记忆损伤幼鼠血清中SOD、MDA水平的影响

4.黄芪总苷对氯胺酮麻醉致记忆损伤幼鼠脑组织中Bcl-2、caspase-3蛋白水平的影响：与正常对照组比较，氯胺酮组幼鼠脑组织caspase-3蛋白表达水平显著升高，而Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)；与氯胺酮组比较，氯胺酮+黄芪总苷各剂量组幼鼠脑组织caspase-3蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，而Bcl-2表达水平均显著升高(P<0.05)，详见图2。

图2 各组幼鼠脑组织中Bcl-2、caspase-3蛋白相对表达量比较与正常对照组比较，*P<0.05；与氯胺酮组比较,#P<0.05

讨 论

全身麻醉药的主要不良反应表现为学习记忆功能障碍。越来越多的研究表明，氯胺酮可影响幼年幼鼠学习和记忆功能[10]。研究发现，多次使用氯胺酮可损伤动物海马神经元，影响其学习记忆功能，其机制与氯胺酮影响动物脑内5-羟色胺(5-HT)和乙酰胆碱(Ach)水平有关[11]。水迷宫实验是一种强迫大鼠、小鼠等实验动物游泳，经过训练对环境和平台有空间记忆，判断并寻找隐藏在水中平台的一种实验方法，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感的学习记忆能力，当水下平台被撤回时，通过平台位置的插入频率来确定动物的记忆。该实验方法广泛应用于学习记忆、阿尔茨海默病、智力与衰老等方面的研究，是目前公认的用于研究学习和记忆能力的方法[12，13]。本研究通过水迷宫实验证实，应用氯胺酮麻醉后，幼鼠逃避潜伏期显著延长，提示复制氯胺酮致幼鼠记忆功能损伤模型成功。

细胞凋亡反映细胞损伤的表现形式之一，其形成过程涉及到多种影响因素和作用机制所介导的细胞死亡过程。但无论哪种作用因素诱导细胞凋亡，其信号通路中均存在共同的调控靶点。凋亡蛋白酶caspase-3的激活是细胞凋亡的指示剂，属于caspase级联反应中最关键的凋亡执行蛋白酶，其在细胞凋亡程序中起枢纽作用。Bcl-2是一种抑制凋亡基因，在细胞凋亡过程中，Bcl-2亦发挥关键作用，其可通过与其他凋亡蛋白的协同作用，调节细胞内线粒体膜通透性，从而调节细胞凋亡信号转导[14～16]。

氧化应激损伤是由于机体内的抗氧化系统遭到破坏致使自由基在体内发生负反应，生成超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢、过氧化亚硝基等自由基和非自由基活性产物，积累堆积造成机体组织细胞受损，从而导致细胞凋亡和坏死。因此，研究记忆损伤动物脑组织细胞凋亡时，并行研究氧化应激损伤，有助于分析记忆损伤机制[17，18]。SOD是机体内重要的氧自由基清除酶之一，可有效清除细胞内各种自由基和非自由基活性产物，同时可以抑制过多的羟自由基的产生，从而抑制氧化应激反应，减少MDA等脂质过氧化产物生成[19，20]。

本研究结果显示，黄芪总苷具有防治氯胺酮麻醉致幼鼠记忆损伤的作用。氯胺酮+黄芪总苷各剂量组的潜伏期均显著低于氯胺酮组，首次穿过平台所在象限需要的时间显著短于氯胺酮组，穿台次数显著多于氯胺酮组。氯胺酮组幼鼠血清中SOD活性下调、MDA含量升高，脑组织中Bcl-2表达减少、caspase-3表达量增高。给予不同剂量的黄芪总苷治疗后，该情况出现改善，氯胺酮+黄芪总苷各剂量组幼鼠血清SOD活性显著提高，MDA表达显著降低，脑组织Bcl-2表达显著增加，caspase-3表达减少。此研究结果表明，黄芪总苷能在一定程度上提高氯胺酮麻醉致记忆损伤幼鼠体内SOD活性，并有效清除氧自由基，增强机体的抗氧化损伤能力。此外，可促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低凋亡相关蛋白caspase-3表达量。上述作用机制可能仅是一方面，有关黄芪总苷防治氯胺酮麻醉致幼鼠记忆损伤具体的作用机制，尚需进一步研究探讨。