重症急性胰腺炎患者外周血Th22细胞水平变化及临床意义

焦 艳 张永辉

急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症，有研究报道显示，有15%～20%的AP患者可进展为重症急性胰腺炎(SAP)，进一步导致多器官功能障碍，病情凶险，病死率极高[1]。随着基础与临床研究的深入，SAP的发病机制及相关临床诊断已取得了较大进展，但早期诊断率仍较低。因此，明确SAP发病机制，针对SAP病情的准确评估与治疗，是提高该病治疗效果及预后的关键。近年来，已有研究表明，SAP的发生与机体免疫系统介导的炎性反应的激活密切相关[2,3]，SAP的免疫防治作为重要的治疗手段而备受关注。辅助型T细胞是免疫炎性反应的重要组成部分，在炎症性疾病的发生、发展过程中扮演着重要的作用[4,5]。其中，Th22细胞作为重要的亚群之一，其特异性的分泌促炎细胞因子IL-22，可激活下游炎性通路，放大炎性反应[6]。然而，在SAP患者体内外周血Th22细胞与疾病发生、发展的相关性如何，目前尚未阐明。本研究通过观察SAP患者外周血Th22细胞及相关细胞因子水平，探讨外周血Th22细胞对SAP的临床诊断价值。

资料与方法

1.研究对象:选取2015年1月～2018年12月于笔者医院就诊住院的SAP患者100例作为观察组，其中男性55例，女性45例，患者年龄34～78岁，中位年龄54.5岁。致病原因：胆囊及胆管结石(62例)、暴饮暴食及酒精性(14例)、高脂血症(8例)、药物性(5例)、其他(11例)，所有患者均符合SAP诊断与治疗指南[7]。排除标准：合并恶性肿瘤、全身严重感染的患者；合并严重肝、肾功能不全的患者；存在其他自身免疫性疾病和免疫缺陷的患者；近半年使用免疫抑制剂的患者。同时选取同期100例普通轻型AP患者为对照组，所有对照组患者均满足AP诊断及治疗指南，同时需排除符合SAP诊断的患者。记录患者一般临床资料如年龄、性别、基础疾病等，同时记录患者入院12h的修正CT严重指数评分(MCTSI)、Ranson评分及APACHEⅡ评分。各组间在性别、年龄、致病原因、基础疾病等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得了陆军军医大学第一附属医院伦理学委员会的批准并征得了患者家属书面知情同意。

2.主要设备及试剂：(1)主要设备：流式细胞分析仪(美国BD公司)；酶标仪(美国Emax公司)。(2)主要试剂：人淋巴细胞分离液、RPMI 1640细胞培养液、佛波酯、离子霉素、莫能菌素、细胞固定液及细胞破膜剂(美国Sigma公司)；鼠抗人CD4单抗及鼠抗人IL-22单抗(美国eBioscience公司)；人血清IL-22和IL-1β酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(中国博士德公司)；AMY、内毒素的 ELISA试剂盒(中国南京建成生物公司)。

3.流式细胞术检测外周血Th22细胞水平：分别抽取两组患者清晨空腹静脉血3ml，经肝素抗凝后，加入淋巴细胞分离液，震荡混匀，经离心后提取单核细胞。取6孔细胞培养板，将上述提取的单核细胞接种于该培养板，同时加入等体积的RPMI-1640培养基。随后加入相关抗菌素(50μl佛波酯，16μl离子霉素及16μl莫能菌素)后，吹打混匀，孵育箱孵育6h。加入抗人CD4单抗10μl，吹打混匀后，室温避光孵育1h，随后加入100μl细胞固定液，经离心后，加入100μl破膜液及5μl IL-22单抗。混匀后加入染色固定液200μl，最后经流式细胞仪检测Th22细胞水平。

4.外周血相关因子及炎性指标的检测:取两组患者清晨空腹静脉血3ml，离心后收集上清，采用ELISA法测定各组间外周血IL-1β、IL-22、AMY及内毒素水平，具体操作依据试剂盒说明书进行。

结 果

1.外周血Th22细胞及相关炎性指标比较:与对照组比较，观察组患者外周血Th22细胞、IL-22、IL-1β、AMY及内毒素水平显著升高，差异有统计学意义(P>0.05)，详见表1及图1。

表1 两组患者外周血Th22细胞及相关炎性指标水平比较

图1 外周血 Th22细胞的流式细胞分析图A.对照组；B.观察组

2.病情严重程度评分比较：与对照组比较，观察组病情严重程度评分(MCTSI评分、Ranson评分及APACHEⅡ评分)均显著升高(P<0.05)。

表2 两组患者病情严重程度评分比较(分，

3.相关性分析:SAP患者外周血Th22细胞与IL-22、IL-1β、AMY及内毒素水平呈显著正相关(r=0.930，P=0.000；r=0.825，P=0.000；r=0.782，P=0.007；r=0.803，P=0.002；r=0.680，P=0.012)；同时与病情严重程度评分(MCTSI评分、Ranson评分及APACHEⅡ评分)呈显著正相关(r=0.820，P=0.000；r=0.830，P=0.000；r=0.747，P=0.009)。

4.外周血Th22细胞水平对SAP患者早期诊断价值的ROC曲线分析:通过以外周血Th22细胞水平来评估SAP患者早期诊断价值，绘制ROC曲线。外周血Th22细胞水平的曲线下面积(AUC)为0.908(95% CI: 0.839～0.976)，其最佳工作点(OOP)分别为3.08，提示按此最佳工作点对SAP患者进行早期诊断预测，其敏感度和特异性分别为87.88%和80.00%，见图2。

图2 外周血Th22细胞对SAP患者早期诊断价值的ROC曲线分析

讨 论

近年来，SAP的发生率及病死率均呈上升趋势，虽然相关基础与临床研究对SAP的发病机制及诊断、治疗取得了一定进展，但病死率仍居高不下[8]。主要原因为胰酶激活，导致机体炎性因子过度释放，常并发多器官功能障碍，造成病情进行性恶化[9]。相关研究显示，早期诊断SAP，可有效的减少并发症及患者病死率[10]。SAP患者机体炎性反应进行性放大的具体机制尚不完全清楚，但随着近年来炎症免疫研究的进展，辅助型T细胞介导的炎性反应在多种自身免疫及炎性疾病中的作用，越来越受到关注[11,12]。特别是以Th22细胞为代表的新型辅助型T细胞亚群，通常情况下，机体Th22细胞处于抑制状态，当受促炎细胞因子如IL-6、TNF-α的刺激作用下，可由CD4+T淋巴细胞转化而来，分泌IL-22，随后激活下游炎性通路，产生炎性级联反应[13,14]。相关研究已显示，外周血Th22细胞参与了炎性疾病的发生、发展过程[15,16]。SAP作为炎性疾病之一，外周血Th22细胞可能在SAP的早期诊断及病情变化的评估过程中，具有重要的临床价值。

相关研究显示，急性胰腺损伤时，体内炎性通路可显著激活，辅助型T细胞如Th17细胞可显著激活，进一步导致下游IL-17及TNF-α水平显著升高，抑制Th17细胞激活，可显著降低急性胰腺炎模型大鼠体内炎性反应，减轻胰腺损伤[17,18]。作为一类新型的辅助型T淋巴细胞亚群，外周血Th22细胞是否参与了SAP的发生，同时与病情严重程度关系如何，目前尚不清楚。本研究结果显示，SAP患者外周血Th22细胞及相关下游炎性因子如IL-22、IL-1β等显著升高，表明SAP患者体内存在持续的炎性状态，其可能参与并促进了SAP的发展过程。

为进一步分析外周血Th22细胞与SAP体内炎性细胞因子及病情严重程度的关系，通过相关性分析显示，外周血Th22细胞与IL-22、IL-1β、AMY及内毒素水平呈显著正相关，提示外周血Th22细胞的激活，可进一步导致相关炎性细胞因子表达增加；同时SAP患者体内外周血Th22细胞水平还与病情严重程度评分(MCTSI评分、Ranson评分及APACHEⅡ评分)呈显著正相关，提示外周血Th22细胞可一定程度反映SAP患者病情严重程度，可能对SAP患者病情严重程度的评估，具有一定的临床运用价值。通过ROC曲线分析外周血Th22细胞水平对SAP患者早期诊断的评估价值，其结果显示，ROC曲线下面积较大，预测价值较高。外周血Th22细胞是炎性反应发起及进一步放大的重要环节，有研究显示，通过有效的抑制体内Th22细胞的激活，可显著降低炎性反应的级联放大，改善炎症性疾病的预后[19,20]。因此，外周血Th22细胞水平不仅可作为评估SAP患者早期诊断的可靠指标，还可能成为其治疗的有效靶标。

综上所述，外周血Th22细胞参与了SAP患者的炎性反应，但有关Th22细胞在SAP发生、发展中的调节机制还有待于进一步研究。