混合盐胁迫下植物促生菌对高粱种子萌发的促生效应

王倩倩 张丽辉 赵骥民

摘要：由盐生植物根际土中分离得到含ACC脱氨酶的PGPR（植物根际促生菌）嗜麦寡养食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），研究其在中性盐与碱性盐条件下对高粱种子萌发的促生效应。结果表明，从30、60、90、120 mmol/L的盐碱胁迫处理条件下，PGPR处理对高粱种子在各项萌发参数上均有显著促生效果。其中接菌的高粱种子的胚芽、胚根比未接菌的要长，长势更好;接菌的比不接菌的根冠比高，说明促生菌在一定程度上促进了植株根部的营养吸收。据此可推测，含ACC脱氨酶的植物促生菌可缓解混合盐胁迫（中性盐与碱性盐）对高粱植株的抑制作用，提高高粱抗盐性，从而促进高粱种子的萌发力。

关键词：植物促生菌;中性盐胁迫;碱性盐胁迫;高粱种子萌发;促生效应

中图分类号： S514.01;Q945.78  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0091-04

现如今，由于全球气候变化，人口不断增长，工业化急剧发展，环境污染逐渐升级等各种因素的影响，导致了土壤盐碱化程度日益加重。在我国，东北地区的松嫩平原盐碱化土地面积达373.3万hm2，而且土壤盐分组成非常复杂，既含有NaHCO3、Na2CO3等碱性盐，又含有NaCl、Na2SO4等中性盐[1]。目前国内外主要集中在NaCl对植物毒害的研究，很少有研究不同盐类混合而引起的混合盐胁迫对植物生长的伤害[2]。

植物促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一类能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物[3-4]。PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物（deleterious rizosphere microorganisms，简称DRMO）都有一定的生防作用，而且对植物吸收利用矿物质营养也有促进作用，并可以产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育[5-6]。近年来已有很多学者研究表明，植物生长促生菌可以间接通过产生抗生素和分泌铁载体等方式抑制或减轻植物病害对植物产生的不良影响，还能通过解磷、固氮、产生植物激素、酶解降低乙烯水平等方式直接刺激和调节植物生长[7-8]。许多植物根际促生菌可以产生吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、维生素（antibiotic）等，以及利用并降解植物产生的乙烯合成前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）），使ACC分解成A-丁酮酸和氨，从而降低了逆境条件下植物体内产生大量的乙烯，促进植物的生长发育[9-10]。所以植物生长促生菌，特别是含ACC脱氨酶的植物促生菌备受各界关注，尤其被认为在逆境条件下能有效促进植物生长。

如今，国内外已有越来越多的专家学者从事植物促生菌的研究，大量实践证明通过接种含ACC脱氨酶的植物生长促生菌，能够大大提高植物的抗逆性[11-13]。含ACC脱氨酶的PGPR的主要作用机制是通过降低逆境乙烯的浓度，促进植物根的伸长，提高植物的抗逆性。故本研究参考Penrose等的研究，采取定向富集分离方法，并只挑取占竞争优势的菌落，筛选出含ACC脱氨酶的PGPR。又根据东北地区的现状，采用高粱这种耐盐植物作为研究对象，再通过种子萌发试验来决速评价PGPR的促生性能，得出PGPR对不同盐碱浓度下高粱的萌发期表现出来的一系列积极影响。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：以ACC为唯一氮源，从生长于高pH盐碱胁迫下的白城地区燕麦根际土中自行筛选分离得到的PGPR菌株。经16S rDNA序列分析，初步确定此种促生菌为嗜麦寡养食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。

供试植物：高粱吉杂83，由吉林省农业科学院作物育种研究所1993年以不育系“352A”为母本，恢复系“116-2-5”为父本杂交育成。1999年经吉林省农作物品种审定委员会审定通过。属中早熟品种，出苗至成熟118 d左右，需≥10 ℃积温2 400～2 500 ℃。抗旱、抗倒、耐密植，抗叶病，抗蚜虫，高抗丝黑穗病。适宜在吉林省的长春、松原、白城地区及熬杂1号的栽培区种植。

培养基：TSB、DF等培养液按文献[14]配方配制。

1.2 材料处理

种子消毒：将吉杂83高粱种子用自来水清洗3遍，在 0.1% HgCl2中消毒3 min，之后用无菌水洗涤5次。

菌悬液制备：供试菌株在TSB培养液中室温（21±1） ℃过夜振荡培养，4 ℃离心收集，菌体细胞用无菌0.03 mol/L MgSO4溶液洗涤，重新悬浮于无菌0.03 mol/L MgSO4溶液制成菌悬液（D600 nm=0.5±0.02）浸种用。

1.3 方法

室溫下将消过毒的高粱种子分为2份。一份浸于 0.03 mol/L MgSO4菌悬液（D600 nm=0.5±0.02），一份浸于无菌0.03 mol/L MgSO4溶液中1 h后，放于标记好的培养皿中。

利用2种中性盐氯化钠和硫酸钠（物质的量之比9 ∶ 1）模拟盐胁迫，利用2种碱性盐碳酸氢钠和碳酸钠（物质的量之比9 ∶ 1）模拟碱胁迫，每种胁迫设置4个梯度，每个梯度5次重复，每个重复50粒高梁种子放在3层滤纸的培养皿中。盐碱胁迫设置的4个浓度梯度为30、60、90、120 mmol/L。将培养皿置于光照培养箱中，培养条件为温度25 ℃/15 ℃，光照14 h/d。每天记录正常发芽的种子个数以计算发芽率和发芽速率，以胚根露出种皮作为发芽标准。连续3 d发芽数不再变化，用刻度尺测量胚根和胚芽长度将未萌发的种子转移到蒸馏水中，进行复萌试验，每天记录发芽数。试验结束计算相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对发芽活力指数、相对生长指标。

在发芽试验的最后一天统计发芽个数，每皿随机测量10个幼苗的胚芽长和胚根长，精确到0.01 cm。

2 结果与分析

2.1 含ACC脱氨酶的PGPR对中性盐胁迫下高粱种子萌发的影响

2.1.1 含ACC脱氨酶的PGPR对中性盐胁迫下高粱种子发芽率、发芽势与集中度的影响 由图1可以看出，随着中性盐胁迫浓度的升高，高粱种子的发芽情况呈逐渐降低趋势。但同一浓度梯度盐胁迫下，接菌的高粱种子的相对发芽率、发芽势、集中度都比未接菌的对照有显著提高（P<0.05）。在盐浓度达到120 mmol/L的时候，未接菌发芽率为67.33%，发芽势为67.33%，集中度为60.67%，而接菌后高粱种子要高于未接菌的指标，发芽率为73.33%，发芽势73.33%，集中度70.00%。并且由7 d后高粱发芽照片也可以看出接菌的高粱种子的胚芽、胚根比未接菌的要长，长势更好。据此可推测，含ACC脱氨酶的PGPR可一定程度上提高高粱种子的萌发率。

2.1.2 含ACC脱氨酶的PGPR对中性盐胁迫下高粱种子萌发指数与活力指数的影响 种子的发芽指数和活力指数可以比发芽率、发芽势更灵敏地表现出种子活力，可以比较全面地

反映植物种子与环境的作用结果，发芽指数和活力指数越高，说明发芽所用时间越短，长势越好。如图2可见，在盐浓度逐渐上升的情况下，种子的发芽指数与活力指数都呈递减，且除盐胁迫30 mmol/L浓度外接菌处理后的高粱种子都要显著高于对照的萌发指数和活力指数（P<0.05）。在盐胁迫60、90、120 mmol/L时，接种PGPR的萌发指数比不接菌显著高 5.39%（P<0.01）、3.11%（P<0.05）、3.61%（P<0.01）;接菌的活力指数比不接菌分别高了40.56%（P<0.01）、5.55%（P<0.05）、18.37%（P<0.01）。从以上数据可推测含ACC脱氨酶的PGPR在一定程度上提高了高粱种子的发芽指数和活力指数，与最终发芽率观察结果相吻合。

2.1.2 含ACC脱氨酶的PGPR对中性盐胁迫下高粱种子根冠比与相对盐害率的影响 相对盐害率是表明植株受到盐碱胁迫的程度。如图3可见，中性盐胁迫对高粱种子的萌发有明显的抑制作用，接菌后的高粱种子比对照对高粱伤害小的多（P<0.05）。根冠比是反映幼苗生长状况的一项指标，一般生长健壮的幼苗有较高的根冠比。中性盐处理的高粱种子接菌的比不接菌的根冠比高，说明促生菌在一定程度上促进了植株根部的营养吸收。

2.2 含ACC脱氨酶的PGPR对碱性盐胁迫下高粱种子萌发的影响

2.2.1 含ACC脱氨酶的PGPR对碱性盐胁迫下高粱种子发芽率、发芽势与集中度的影响 由图4可见，从30～120 mmol/L 的碱胁迫浓度条件下，高粱种子发芽率、发芽势、集中度整体要低于盐胁迫，且接菌的要整体稍高于未接菌的。在试验最高浓度碱胁迫处理（120 mmol/L）尤其明显，未接菌的发芽率为73.33%、发芽势为66.00%、集中度为57.33%，而接菌处理后的发芽率为82.00%、发芽势为70.67%、集中度为63.33%。同浓度碱胁迫接菌可以在很小程度上促进高粱的萌发，因此说明，碱胁迫对高粱的萌发伤害作用要高于盐胁迫的影响，尽管随着混合盐碱的浓度升高，延缓了发芽时间，但最终发芽率仍维持较高的水平，这一结果说明高粱是一种优质的作物。

2.2.2 含ACC脱氨酶的PGPR对碱性盐胁迫下高粱种子萌发指数与活力指数的影响 由图5看出，碱性盐胁迫处理高粱种子均引起种子萌发指数和活力指数降低，而且随着碱胁迫浓度的增加，抑制作用逐渐增强。在低碱浓度下 30 mmol/L 接菌和不接菌处理高粱种子的萌发指数和活力指数均不明显，在浓度60～120 mmol/L，对高粱种子萌发的抑制作用明显增大，当浓度为120 mmol/L时，接菌处理的高粱种子比对照的萌发指数和活力指数分别提高了3.74百分点和16.19百分点。由此看出，接菌处理后的高粱种子可缓解碱胁迫对其的伤害作用，萌发指数和活力指数都有显著提高。

2.2.3 含ACC脱氨酶的PGPR对碱性盐胁迫下高粱种子根冠比与相对盐害率的影响 随着碱胁迫浓度的升高，高粱所受的毒害亦随之增强，高粱种子的相对盐害率随之升高，同时

其根冠比由于抑制增强而降低（图6）。当处于低碱胁迫时（30 mmol/L）接菌处理和对照高粱的根冠比无显著性差异，随着碱浓度的上升，尤其在120 mmol/L时，接菌处理的高粱植株根冠比比对照提高了7.22百分点，且接菌处理后的相对盐害率比对照降低了8.67百分点。从以上试验结果得出，含ACC脱氨酶的植物促生菌可缓解碱性盐对高粱植株的抑制作用，提高高粱抗盐性，从而促进高粱种子的萌发力。

3 讨论

以ACC为唯一氮源，从白城地区盐生植物根际土自行筛选出的菌株，经过16S rDNA序列分析，鉴定得出为一种嗜麦寡养食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。经无菌育种萌发试验研究表明，含ACC脱氨酶的PGPR均能不同程度地显著缓解中性盐和碱性盐胁迫对高粱种子的影响，促进植物生长;在无盐胁迫情况下，对高粱种子生长无显著促进作用。从30～120 mmol/L的碱性盐胁迫处理条件下，高粱种子发芽率、发芽势、集中度整体要低于中性盐胁迫，且接菌的要整体稍高于未接菌的指标。在盐浓度逐渐上升的情况下，种子的发芽指数与活力指数都呈递减趋势，且除盐胁迫 30 mmol/L 浓度外接菌处理后的高粱种子都要明显高于对照的萌发指数和活力指数（P<0.05）。随着胁迫浓度的升高，碱性盐比中性盐对高粱的毒害更强，相对盐害率更高，PGPR处理的高粱种子比没有处理的根冠比高，说明促生菌在一定程度上促进了植株根部的营养吸收。从以上试验结果得出，含ACC脱氨酶的SM菌株可缓解中性盐和碱性盐对高粱植株的抑制作用，提高高粱抗鹽性，从而促进高粱种子的萌发力。

总之，通过人工模拟试验在混合性复杂盐碱胁迫下，含ACC脱氨酶的S. maltophilia菌株浸种高粱后可以在一定程度上促进高粱植株根长、芽长等途径使植株获得更多养料，以改善植株生长状况、改善植物所处的不良环境。但本试验未全面考虑植物促生菌在不同植物根际的定殖能力和利用生物修复土壤的有机结合，还需进一步在野外进行苗期的研究。

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