攀枝花芒果遗传多样性的RAPD分析

刁毅

摘要：采用RAPD分子标记技术对12个芒果品种进行遗传多样性研究。结果发现，6条RAPD引物共检测到36条清晰谱带，其中多态性条带占比为77.78%。芒果在物种水平上遗传多样性较高，而在居群水平上遗传多样性相对较低;居群间遗传变异较高，在居群水平上，金白花的遗传多样性最高，遗传分化程度最低;乳芒和马亚的遗传多样性最低，遗传分化程度最高。聚类分析结果表明，相似系数为0.72时，12种芒果品种可分为4个大类群，金白花和鹰嘴芒的遗传一致度最大，贵妃和鹰嘴芒遗传一致度最低。

关键词：芒果;RAPD;分子标记;遗传多样性

中图分类号： S667.701  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0035-03

芒果（Mangifera indica L.）起源于东南亚，属漆树科（Anacardiaceae）芒果属（Mangifera），是热带、亚热带水果之一，在亚洲被誉为“水果之王”[1-2]。我国是世界上十大芒果生产国之一，芒果种植主要分布在年气温较高的海南、台湾、广西、广东、云南、四川、福建等地区。海南、广西和云南等地是世界芒果原产地之一，拥有丰富的野生芒果资源[3-5]。四川省芒果主产区主要分布在攀西干热河谷地带，该区域全年热量充足，日照时数长，昼夜温差大，干湿季明显，冬春气温高，全年基本无霜，芒果花期无梅雨，挂果期风量少，是全国少有的适宜种植芒果的地区[6-7]。本研究以云南、广西芒果品种作对照，分析攀枝花主栽芒果品种的遗传多样性，旨在为攀枝花芒果种质资源利用、引种、育种、种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

12份芒果种质嫩叶采集后，放入冰盒中，在-20 ℃冰箱保存。12个芒果品种名称与产地信息见表1。

1.2 DNA提取

DNA提取采用改良十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[8-9]。

1.3 RAPD-PCR扩增

随机扩增多态性DNA（RAPD）-PCR扩增采用马艳芝等报道的方法[10]。

RAPD-PCR反应体系为20 μL，其中，8 μL ddH2O，1 μL DNA模板，1 μL RAPD引物，10 μL 2×Taq PCR Master Mix。RAPD-PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，37 ℃退火40 s，72 ℃复性110 s，35次循环;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.4 琼脂糖凝胶电泳

用50 mL 1×TAE和0.5 g琼脂糖配制1.0%琼脂糖凝胶，煮沸并适度冷却后加入5 μL GoldviewⅠ型核酸染色剂，摇匀后倒胶。120 V电泳30 min后，在凝胶成像系统中扫描成像。

1.5 数据分析

根据凝胶电泳条带的有无计数，有带（显性）记为1，无带（阴性）记为0，强带和弱带均赋值为1，从而形成RAPD表型原始数据矩阵。对RAPD表型原始数据矩阵用POPGENE32、AMOVA-PREP1.01、NTSYS2.10e等软件进行遗传多样性分析与聚类分析[11-15]。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及多态性

从表2可以看出，从30条RAPD引物中筛选出6条谱带清晰、多态性高、重复性好的RAPD引物;用6条RAPD引物对12个不同芒果品种DNA进行扩增，共检测到36个条带，其中多态性条带28条，多态率为77.78%。

2.2 芒果遗传多样性分析

用POPGENE32软件计算得到的芒果各品种居群遗传参数见表3。在物种水平上，多态位点百分率（PPB）为91.67%，观察等位基因数（Na）为1.916 7，有效等位基因数（Ne）为1.638 1，Neis基因多样性指数（He）为0.355 6，Shannon多样性指数（I）为0.520 0;在居群水平上，PPB平均值为27.08%，Na为1.270 8，Ne为1.162 6，He为0.260 5，I为 0.140 8。说明芒果物种水平遗传多样性比居群水平高。从表3还可以看出，在居群水平上，金白花居群的PPB、Na、He和I最高，说明其遗传多样性最高;乳芒和马亚居群的PPB、Na、He和I均最低，说明其遗传多样性最低。

由表6可知，对居群间遗传多样性所占比例（Shannon居群分化系数）与遗传分化系数（Gst=0.736 1）作对比得出，金白花Shannon居群分化系数最低，低于遗传分化系数;马亚和乳芒Shannon居群分化系数最高，高于遗传分化系数，说明金白花居群遗传分化程度最低，马亚居群和乳芒居群遗传分化程度最高。

2.4 遗传距离与聚类分析

遺传一致度和遗传距离可以反映群体间遗传亲缘关系，12个芒果品种居群间的遗传距离与遗传一致度见表7。12个品种居群间的遗传一致度在0.484 6～0.904 8之间;Neis遗传距离范围在0.100 0～0.724 5之间。其中，金白花居群和鹰嘴芒居群的遗传一致度最大，为0.904 8，遗传距离最小，为0.100 0;贵妃居群和鹰嘴芒居群遗传一致度最小，为0.484 6，遗传距离最大，为0.724 5。

根据POPGENE32软件得出的遗传一致度用NTSYS2.10e软件进行聚类分析。由图1可知，相似系数为0.72时，12种芒果品种可分为4个大类群：乳芒和攀育2号为一类群;鹰嘴芒、金白花、椰香、马亚和热农10号为一类群;吉禄和红苹为一类群;热研16号、贵妃和海顿为一类群。

3 讨论

分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记，是继形态标记、细胞标记、生化标记之后发展起来的新技术，其操作简单、快速，不受基因表达与季节、环境条件的影响，被广泛应用于遗传多样性检测、构建核心种质、种质资源鉴定与分类、亲缘关系分析、杂种鉴定、遗传图谱构建等方面。RAPD技术是用随机引物对DNA未知序列基因组进行多态性分析的技术，该技术具有操作简单、检测速度快、灵敏度高，可以不依赖种属特性和基因组结构进行的优点[16]。

本研究选用8份攀枝花芒果主栽品种，同时用3份云南昆明芒果品种与1份广西南宁芒果品种作对照，通过RAPD技术分析发现，芒果在物种水平上遗传多样性参数均高于居群水平平均值，说明芒果在物种水平上遗传多样性高。

遗传分化系数（Gst）是衡量群体遗传分化最常用的指标，其数值表示在总的遗传变异中群体间变异所占的比例。当Gst在0～0.05之间时，表示遗传分化程度弱;当Gst在0.05～0.15之间时，表示遗传分化程度中等;当Gst在0.15～0.25之间时，表示物种遗传分化程度高;当Gst大于0.25时，表示遗传分化程度很高[17]。在本研究中，Gst=0.736 1，说明芒果居群间的变异占总变异的73.61%，居群内变异占总变异的26.39%;Gst大于0.25，说明芒果品种遗传分化程度很高。

芒果遗传分化系数（0.736 1）、AMOVA方差分析的居群分化指数（0.621 7）与Shannon居群分化系数（0.729 2）在数值上略有差异，但所表现的遗传趋势基本一致，表明芒果居群间的遗传变异与遗传分化大于居群内。

聚类分析结果可以看出，12份芒果品种的遗传一致度在 0.7～0.9之间，说明这些芒果主栽品种具有丰富的遗传多样性;但鹰嘴芒与金白花之间遗传遗传一致度约为0.9，说明它们之间的亲缘关系比较接近。对攀枝花芒果主栽品种遗传多样性的深入研究，将有助于攀枝花芒果引种、育种、种植的有序开展，从而促进攀枝花芒果产业的发展。

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