泽泻不同部位提取物体外抗氧化活性的比较研究

2019-10-25杨利利蓝梦柳陈国翔吴水生

福建中医药 2019年5期

杨利利，蓝梦柳，陈国翔，许文，吴水生

（福建中医药大学药学院，福建福州 350122）

泽泻（Alismatis Rhizoma）来源于泽泻科泽泻属植物泽泻［Alisma orientale（Sam.）Juzep.］的干燥块茎，其性寒，味甘，具有利湿、清热、化浊降脂等功效［1-2］。现代药理学研究表明，泽泻具有利尿［3］、降血糖［4］、降血脂、抗脂肪肝［5］及动脉粥样硬化［6］、抗肿瘤［7］等药理作用。泽泻主产地为福建、江西广昌、四川等地，作为福建的道地药材，以其生产历史悠久、品质优良而被列为上品［8-9］。根据调研发现泽泻花苔（泽泻的花茎）常被当地居民用来食用。美国学者Harman在1956年提出自由基学说，认为生物体内的多种代谢途径都会产生高度氧化活性的自由基，自由基生成和消除通常处于平衡状态，当机体自由基过剩时，就会直接或者间接造成细胞活力下降，引起机体衰老、诱发细胞癌变等各种疾病［10］。因此，抗氧化剂能够减少自由基对机体氧化损伤，有效抑制疾病的发生，而现代药理研究表明泽泻块茎具有抗氧化活性，但是对泽泻不同部位，尤其泽泻花苔体外抗氧化活性的评价研究未见报道。因此，为了解泽泻块茎、花苔、茎、叶等不同部位的抗氧化活性，本研究通过1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除法和铁离子还原法（FRAP）［11-12］对比分析泽泻不同部位提取物的体外抗氧化效果，以期为泽泻花苔资源药食两用功能开发提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器 ME204E／02电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ-200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHP-9052电热恒温培养箱（上海-恒科技有限公司）；多功能酶标仪（帝肯奥地利有限责任公司）。

1.2 试药 ABTS试剂、FRAP试剂（碧云天生物技术）；S30629 DPPH（上海源叶生物科技有限公司）。原材料泽泻10批样品采自福建建瓯的吉阳，经福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴别基原为［Alisma orientale（Sam.）Juzep.］，样本寄存于福建中医药大学药学院标本室。泽泻洗净，分为块茎、茎、叶、花苔不同部位，60℃烘干，粉碎后过80目，备用。

2 实验方法

2.1 样品制备精密称取1 g样品粉末置于50 mL的锥形瓶中，加入25 mL甲醇，密封，称重。超声（250 W，40 kHz）提取 30 min。用甲醇补足失重，0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.2 抗氧化能力测定

2.2.1 清除DPPH自由基精密称取DPPH粉末适量，加入甲醇溶解制成50 μg／mL的DPPH溶液，避光保存。在96孔板中加入100 μL DPPH溶液，再分别加入不同浓度的样品液及VC标准品，最后加甲醇至每个检测孔为200 μL，避光30 min。另将DPPH溶液换为甲醇溶液，重复上述操作，以甲醇做空白对照。利用多功能酶标仪测定519 nm处的A值，计算清除率和IC50值。

As：样品＋DPPH溶液；Ab：样品＋甲醇溶液；Ac：DPPH 溶液；Ab'：甲醇溶液

2.2.2 清除ABTS自由基取等体积ABTS溶液和氧化剂溶液混合，室温避光保存16 h，得ABTS工作母液。用80%的无水乙醇稀释ABTS工作母液，使其在734 nm处的吸光度为0.65～0.75，相应的405 nm处的吸光度在1.4左右。在96孔板中加入100 μL ABTS工作液，再分别加入不同浓度的样品液及VC标准品，最后加甲醇至每个检测孔为200 μL，室温下孵育6 min。利用多功能酶标仪测745 nm处的A值，计算清除率和IC50值。

A1：样品的 A 值；A2：空白对照；A0：ABTS 工作液的A值

2.2.3 FRAP法测抗氧化能力取TPTZ溶液、TPTZ稀释液、检测缓冲液按1∶10∶1的比例混匀，放入37℃电热恒温培养箱孵育5 min。在96孔板中，加入100 μL已配制好的FRAP工作液，再分别加入不同浓度的样品液、FeSO4标准溶液及VC标准品，最后加甲醇至每个检测孔为200 μL，室温下孵育5 min。利用多功能酶标仪测593 nm处的A值，以A值对不同浓度的FeSO4标准溶液作标准曲线，根据标曲计算总抗氧化能力。

2.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件处理书局。所得实验数据均为3次重复实验结果的均值，数据用（）表示。

3 结果

3.1 清除DPPH自由基泽泻不同部位对DPPH自由基均有一定清除作用，在实验浓度范围内，清除率随浓度增大而增大。泽泻各个部位抗氧化能力大小依次为泽泻花苔＞泽泻茎＞泽泻叶＞泽泻块茎。见表1。

3.2 清除ABTS自由基泽泻不同部位对ABTS自由基均有一定清除作用，在实验浓度范围内，清除率随浓度增大而增大。泽泻各个部位抗氧化能力大小依次为泽泻花苔＞泽泻叶＞泽泻茎＞泽泻块茎。见表2。

表2 泽泻不同部位对ABTS自由基清除率%

3.3 FRAP法测抗氧化能力以A值对不同浓度的FeSO4标准溶液进行线性拟合，得标准曲线为Y＝0.005 1 X＋0.064 6，r＝0.999 3，根据标准曲线计算泽泻不同部位的FRAP值。泽泻各个部位抗氧化能力大小依次为泽泻花苔＞泽泻茎＞泽泻叶＞泽泻块茎。见表3。

表3 泽泻不同部位的FRAP值

3.4 泽泻不同部位抗氧化能力比较 IC50值是清除率为50%时的浓度值，由SPSS 20.0计算各个样品的IC50值，结果如表4所示，IC50值越小，表明其抗氧化能力越强。FRAP法结果总抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度来表示，FRAP值越大抗氧化能力越强。

4 讨论

本研究通过DPPH法、ABTS法和FRAP法三种抗氧化能力检测方法比较，测定泽泻不同部位对DPPH自由基、ABTS＋自由基的清除率及Fe3＋的还原能力，从而对泽泻花苔、泽泻块茎、泽泻茎、泽泻叶的抗氧化能力进行比较，结果表明抗氧化能力随着浓度的升高而提高，且泽泻不同部位对DPPH、ABTS自由基和Fe3＋表现出不同的抗氧化能力。在DPPH自由基清除实验中，泽泻各个部位抗氧化能力大小依次为泽泻花苔＞泽泻茎＞泽泻叶＞泽泻块茎，在ABTS自由基清除实验中，泽泻各个部位抗氧化能力大小依次为泽泻花苔＞泽泻叶＞泽泻茎＞泽泻块茎，在FRAP法测抗氧化能力实验中泽泻各个部位抗氧化能力大小依次为泽泻花苔＞泽泻茎＞泽泻叶＞泽泻块茎。