植物乳杆菌DL3对草鱼片中腐败菌的抑制

(渤海大学食品科学与工程学院,国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)

草鱼是中国淡水养殖的四大家鱼之一,营养丰富,深受广大消费者的喜爱。由于鱼体肠道和外表携有微生物,肌肉组织蛋白酶丰富,体表黏液多,在加工贮藏以及运输销售等环节极易受微生物污染导致腐败变质,造成巨大的经济损失[1-2]。引起草鱼腐败的腐败菌主要为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens),高祥英[3]对草鱼、鲫鱼和鳙鱼冷藏过程中的菌相变化进行分析,发现希瓦氏菌和假单胞菌为货架期终点的优势腐败菌。杨娟等[4]从草鱼冷藏肉片中分离获得3种优势腐败菌，经鉴定为草莓假单胞菌、腐败希瓦氏菌和中间气单胞菌。

淡水鱼保鲜技术包括低温保鲜、化学保鲜、气调保鲜、辐照保鲜及速冻热杀菌等[5]。目前,传统保鲜方法已不能满足消费者对绿色健康的需求,新型生物保鲜技术已逐渐成为研究的热点。在水产品保鲜领域,多应用茶多酚、酶制剂、鱼精蛋白、甲壳质、微生物代谢产物等控制微生物引起的腐败[6-8]。郭良辉等[9]将溶菌酶与Nisin复合进行蚌肉保鲜研究,结果表明产品中细菌菌落总数和TVB-N指标得到了很好的控制。杨辉等[10]应用植物精油-EVOH包装膜作为草鱼鱼肉生物保鲜剂,1.0%丁香油+1.0%葡萄籽油活性成分制成的活性薄膜对鱼肉的保鲜效果最佳,在4 ℃下保鲜货架期达到8 d。刘丛丛等[11]采用复合制剂涂膜法保鲜草鱼,Lb.paracaseiH9菌体发酵液+1%海藻酸钠复合涂膜处理的鱼肉保鲜效果最好,在4 ℃条件下贮藏期可达到11 d。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一种新型生物保护剂,主要通过生态位和营养物竞争、形成酸性环境和产生拮抗代谢产物等方式控制腐败和致病微生物[12]。乳酸菌素是一种天然的生物防腐剂,可以抑制或杀灭食品中致病和腐败微生物[13]。Gómez-Sala等[14]从鱼和鱼产品中分离的两株乳酸菌LactobacilluscurvatusBCS35和EnterococcusfaeciumBNM58,能够抑制鱼类腐败和食源性致病菌的生长。Lv等[15]从传统发酵酸菜中分离得到1株对铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌具有较强降解作用的菌株DL3,对两株菌的抑菌直径分别为16.53±0.00和12.15±0.32 mm,经生理生化鉴定和16S rRNA序列分析确定菌株DL3为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

本文以草鱼片为载体,验证植物乳杆菌DL3对铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌的控制效果,通过测定草鱼片感官品质、细菌学指标和理化指标,探究以菌株DL3作为生物保鲜剂在水产品防腐保鲜中应用的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草鱼 辽宁省锦州市林西路水产市场;植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DL3 从传统东北酸菜中分离[15];铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 9027、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)ATCC 8071 本实验室保藏;MRS培养基、LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、平板计数培养基、铜绿假单胞菌CFC选择培养基、铁琼脂培养基 青岛海博生物技术有限公司。

AF-10制冰机 上海斯科茨曼制冰机系统有限公司;SPX-250生化培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂;5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;GI54DS高压灭菌锅 至微仪器有限公司;DL-CJ-2N超级洁净工作台 北京市东联哈尔仪器制造有限公司;THZ-D台式恒温振荡器 太仓市实验设备厂;DZF-6050型真空干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;UV2550紫外可见分光光度计 日本岛津;IKA Vortex GENIUS 3振荡器 德国IKA公司;PHSJ-3F pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;Kjeltec-8400全自动定氮仪 丹麦Foss公司;TA.XT-plus质构仪 Stable Micro Systems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株DL3无细胞上清液的制备 将-80 ℃保存的菌株DL3接种于MRS液体培养基中,以2.0%的接种量传代培养2次后,37 ℃培养12 h。4 ℃ 6000 r/min离心15 min,上清液用0.45 μm滤菌器过滤除菌,得无细胞上清液(cell free supernatants,CFS),4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 受试菌菌悬液制备 将-80 ℃保存的铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌接种于LB培养基中,以1%的接种量传代培养1次,37 ℃培养12 h,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释,制成约106CFU/mL菌悬液,4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 菌株DL3 CFS对腐败菌最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用液体二倍稀释法,菌株DL3 CFS浓缩100倍后冷冻干燥,用LB液体培养基将冷冻干燥产物稀释至终浓度分别为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL,分别取5.0 mL作为实验组,以不加菌株DL3 CFS的LB培养基为对照组,分别加入200 μL 106CFU/mL的铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌菌悬液,于30 ℃ 150 r/min培养24 h,用肉眼观察,没有变浑浊的最低浓度为菌株DL3 CFS的MIC,重复3次。

1.2.4 菌株DL3 CFS对腐败菌生长曲线的影响 在106CFU/mL铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌菌悬液中加入菌株DL3 CFS使DL3 CFS终浓度为0.4 MIC,于30 ℃ 150 r/min 培养20 h,每隔2 h测OD600值,以不加DL3 CFS为对照组,绘制生长曲线。

1.2.5 草鱼样品预处理 将鲜活的草鱼置于洁净泡沫箱中,置于4 ℃冷库中,层鱼层冰方式冷冻致死。将刚死的草鱼置于无菌操作台内已灭菌的砧板上,用灭菌后的手术刀将草鱼去皮、去内脏、头部及尾部,取背部鱼肉切成约10.0 g的草鱼片,喷洒100 μL 75%的乙醇,在酒精灯下停留1～2 s,使乙醇完全挥发,随后分为6组。在鱼片表面充分喷洒生理盐水(NS),作为阴性对照组;在鱼片表面充分喷洒CFS;在鱼片表面充分喷洒106CFU/mL铜绿假单胞菌菌悬液,作为阳性对照组;在鱼片表面充分喷洒106CFU/mL铜绿假单胞菌菌悬液,待其全部渗入鱼块后在灭菌滤纸上沥干,再喷洒CFS;在鱼片表面充分喷洒106CFU/mL腐败希瓦氏菌菌悬液,作为阳性对照组;在鱼片表面充分喷洒106CFU/mL腐败希瓦氏菌菌悬液,待其全部渗入鱼块后在灭菌滤纸上沥干,再喷洒CFS。每组必须保证鱼片喷洒液体后,在灭菌滤纸上沥干,然后装入已灭菌的保鲜袋,封口后置于4 ℃冷藏10 d,每隔2 d分别取出适量6组鱼肉进行相关指标测定。

1.2.6 草鱼样品感官评价 参照Barbosa等[16]的方法。冷藏0～10 d的草鱼片以色泽、气味、组织状态和肌肉弹性为评价指标,各指标分为好、较好、一般、较差和差5个级别,分值分别为5、4、3、2、1分。以草鱼片4项得分平均值为鱼肉感官评定结果,评定人员由10人组成,具体评分结果见表1。

表1 草鱼片感官评定评分标准Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation for grass carp slices

1.2.7 草鱼片中理化和微生物指标测定

1.2.7.1 细菌菌落总数测定 在无菌操作台内,每隔2 d称取冷藏在4 ℃的1.2.5中预处理的6组鱼肉10.0 g,绞碎后置于90 mL灭菌的生理盐水中,连续称取10 d。按GB 4789.2-2016《食品微生物检验菌落总数测定》进行测定[17]。经充分振荡后10倍梯度稀释,选择10-4、10-5和10-6三个稀释度,取1 mL稀释液与20 mL菌落计数培养基混匀,倾注在平板上,37 ℃培养48 h,做3次重复。以灭菌的稀释液为空白对照。

1.2.7.2 铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌菌落数量的测定 称取10.0 g绞碎的鱼肉置于90 mL灭菌的生理盐水中,按GB 4789.2-2016《食品微生物检验菌落总数测定》进行测定[17]。充分振荡后1∶10稀释,选择3个适宜的稀释度,取1 mL稀释液与20 mL铜绿假单胞菌CFC选择性培养基混匀(腐败希瓦氏菌用铁琼脂培养基),倾注平板,37 ℃培养48 h,3组平行,以灭菌的稀释液为空白对照。

1.2.7.3 pH的测定 依照GB/T 5009.45-2003[18]测定,称取10.0 g绞碎的鱼肉样品于烧杯中,加入新鲜煮沸后冷却的蒸馏水100 mL,均质,静置30 min后过滤,用pH计测定滤液pH。

1.2.7.4 挥发性盐基总氮(TVB-N)测定 TVB-N采用 GB 5009.5-2016标准方法进行测定[19]。称取10.0 g绞碎的鱼肉置于烧杯中加蒸馏水至100 mL,均质后,浸渍30 min后过滤,吸取5 mL滤液置于消化管中,加入5 mL浓度为10 g/L的氧化镁悬浊液进行蒸馏,再加入含5滴混合指示剂的10 mL硼酸吸收液,蒸馏5 min后用0.01 mol/L的标准盐酸滴定,根据消耗的盐酸量计算TVB-N(mg/100 g)含量,公式如下:

式中:V1:滴定样品时所需标准盐酸的体积,mL;V2:滴定空白时所需标准盐酸的体积,mL;c:标准盐酸的浓度,mol/L;m:样品的质量,g。

1.3 数据处理

采用Origin 8.0绘图,SPSS 19.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 菌株DL3 CFS对腐败菌生长曲线的影响

如图1,菌株DL3 CFS对铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度分别为4.0和8.0 mg/mL。在腐败希瓦氏菌菌悬液中添加菌株DL3 CFS后的生长曲线如图1A所示,与对照组相比,添加菌株DL3 CFS后生长曲线相对滞后,进入延迟期和稳定期的时间延长4 h,明显缩短了腐败希瓦氏菌对数期的生长速率和生长期,最终菌浓与对照组相比明显下降,表明菌株DL3 CFS能抑制腐败希瓦氏菌对数期菌体的分裂,从而抑制腐败希瓦氏菌的生长。铜绿假单胞菌菌悬液中添加菌株DL3 CFS后生长曲线如图1B所示,对照组呈典型细菌生长曲线,添加菌株DL3 CFS后,细菌生长曲线的最高OD600值比对照组下降了2个数量级,表明菌株DL3 CFS对铜绿假单胞菌生长具有较强的抑制作用。

图1 菌株DL3 CFS对腐败菌生长曲线的影响Fig.1 Effect of strain DL3 CFS on the growth curve of spoilage bacteria 注:A:腐败希瓦氏菌,B:铜绿假单胞菌。

2.2 感官评分

铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌处理组的感官评分变化如图2所示。草鱼的初始感官评分为20分,随后在贮藏过程中草鱼的感官评分随着时间的延长而逐渐下降,在第6 d时,阳性对照组和阴性对照组鱼肉有腥臭味,感官评分分别为11分和12分,到了可接受的临界值,阳性实验组和阴性实验组感官评分分别为15分和14分,没有臭味。第8 d时阴性实验组感官评分为11分,低于可接受临界值,阳性实验组感官评分为13分,还在可接受范围。说明草鱼经菌株DL3 CFS单独处理能延长保鲜期达8 d,经DL3 CFS处理并添加铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌后,可延长草鱼鱼片保鲜期达6 d。以上结果同Brillet等[20]研究应用菌株C.divergensV41抑制冷冻烟熏鲑鱼中单增李斯特菌的感官品质变化一致。

图2 草鱼片的感官评分Fig.2 Grass carp slices sensory scores注:a:铜绿假单胞菌,b:腐败希瓦氏菌。

2.3 理化和微生物指标

2.3.1 细菌菌落总数 细菌菌落总数可判定食品被微生物污染程度及卫生质量,能直接反映食品是否符合食品安全卫生要求,细菌菌落总数的数值在一定程度上标志着食品卫生品质的优劣[17]。图3表示草鱼片在不同处理条件下细菌菌落总数的变化情况。由图3可知,草鱼片的细菌总数随贮藏时间延长而增加,但不同方法处理后细菌总数增长速度不同。按照SC/T 3108-2011的规定[21],细菌总数小于6.0 lg CFU/g为合格品。在初始时,细菌菌落总数为2.6～3.0 lg CFU/g。4 d时,生理盐水处理组和铜绿假单胞菌处理组的细菌总数分别为6.48、6.46 lg CFU/g,表明草鱼已经开始腐败,而此时经菌株DL3 CFS处理后的铜绿假单胞菌组的菌落总数为4.52 lg CFU/g,仍为合格品。6 d时,经腐败希瓦氏菌单独处理的细菌总数也超过6.0 lg CFU/g,经菌株DL3 CFS处理过的3组鱼片仍为合格品。第8 d时,DL3 CFS处理后的腐败希瓦氏菌组和CFS单独处理组的菌落总数分别为5.51和5.84 lg CFU/g。10 d时,铜绿假单胞菌处理组达7.46 lg CFU/g,腐败希瓦氏菌为7.40 lg CFU/g,超过淡水鱼的最大可接受水平。说明经菌株DL3 CFS处理过的3组草鱼保鲜效果较好,至少能延长2 d保质期。

图4 不同处理条件下草鱼片中铜绿假单胞菌(A)和腐败希瓦氏菌(B)数量的变化Fig.4 Changes in total P. aeruginosa(A) and S. putrefaciens(B)counts in grass carp slices

2.3.2 铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌菌落数量 草鱼片中铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌的数量测定结果如图4所示,草鱼片中铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌的数量随着贮藏时间的延长而增加,但经不同方法处理后细菌总数的增加速度不同。草鱼片中初始的铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌的计数分别为2.3～2.7 lg CFU/g和2.1 lg CFU/g。图4A中,在10 d时,添加DL3 CFS处理铜绿假单胞菌后比铜绿假单胞菌单独处理组的铜绿假单胞菌菌落数降低了2.06 lg CFU/g,这表明菌株DL3 CFS够抑制铜绿假单胞菌的生长和繁殖,从而延缓草鱼的腐败变质。图4B中,在10 d时,经添加DL3 CFS的腐败希瓦氏菌实验组比腐败希瓦氏菌单独处理的腐败希瓦氏菌数量降低了0.97 lg CFU/g,说明菌株DL3 CFS能够抑制引起草鱼腐败的腐败希瓦氏菌的生长和繁殖。因此,菌株DL3 CFS对铜绿假单胞菌有更强的拮抗活性。

2.3.3 pH 由图5可知,在贮藏过程中草鱼片的pH随时间的延长呈现先减后增的“V”型变化趋势。pH下降是由糖原降解及ATP和磷酸肌酸等物质分解产生乳酸和磷酸等物质引起,而随着时间的延长鱼肉的蛋白质在微生物的酶作用下逐渐降解产生碱性物质,使鱼肉pH升高。在4 d时所有组的pH均达到最低值,随后阴性对照组和阳性对照组pH迅速上升,鱼肉腐烂明显,阴性实验组和阳性实验组的pH上升缓慢,pH均低于对照组。在储存结束时,处理样品的pH为6.65～6.74,但对照样品的pH达到7.02～7.10,这表明对照样品产生了一些与腐败有关的碱性代谢物。结果表明,菌株DL3 CFS处理样品后的pH较低,可能抑制微生物生长或内源蛋白酶活性,从而延长草鱼保质期。本文结果与李颖畅等[22]测定蓝莓叶多酚和壳聚糖对冷藏秘鲁鱿鱼鱼丸品质影响的结果一致。

图5 不同处理条件下草鱼片pH的变化Fig.5 Changes in pH of grass carp slices with different treatment conditions

2.3.4 TVB-N 图6表示草鱼片贮藏过程TVB-N的变化,由图6可知,在贮藏过程中草鱼片的TVB-N值随时间的延长逐渐增加。按照SC/T 3108-2011[20]的规定,TVB-N≤13 mg/100 g为一级新鲜度,TVB-N≤20 mg/100 g为合格品。最初的TVB-N值为(7.48±0.20) mg/100 g。在4 ℃贮藏4 d时,添加了菌株DL3 CFS的三组草鱼片TVB-N值低于13 mg/100 g,为一级新鲜度,但阳性对照组和阴性对照组的TVB-N值不断增加且大于13 mg/100 g,表明草鱼片开始变质。在4 ℃贮藏10 d时,只有经CFS单独处理组和经添加腐败希瓦氏菌的DL3 CFS处理的TVB-N值仍低于20 mg/100 g，为合格品。表明菌株DL3 CFS能够降低细菌菌落总数及其引起释放挥发性盐基氮。该结果与Zang等[23]探究不同抗氧化剂壳聚糖涂膜对冷藏草鱼保鲜的影响中得到的结果一致。

图6 不同处理条件下草鱼片TVB-N的变化Fig.6 Changes in TVB-N of grass carp slices with different treatment conditions

3 结论

本文主要研究了植物乳杆菌DL3 CFS对草鱼片中腐败菌的控制,测定了铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌菌落数、感官分值、pH和TVB-N等指标的变化过程。结果表明在4 ℃贮藏过程中,经菌株DL3 CFS处理后能较好地保持草鱼片的感官分值,保鲜效果较好。菌株DL3 CFS可使铜绿假单胞菌和腐败希瓦氏菌的细菌数量分别降低了2个和1个数量级。贮藏过程中草鱼片的pH随时间的延长先减后增,说明菌株DL3 CFS能抑制草鱼鱼丸的腐败变质。菌株DL3 CFS处理后TVB-N值仍为合格品。研究表明植物乳杆菌DL3 CFS能有效抑制贮藏过程中草鱼片中腐败菌的生长繁殖,减缓鱼片的脂肪氧化以及肉中蛋白质的降解,使货架期至少延长2 d。菌株DL3 CFS可作为生物保鲜剂用于草鱼及类似产品的冷藏保鲜中,具有良好的应用前景。