季铵化卤胺聚合物改性Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备及抗菌性能研究

肖凌寒, 李 娜, 卜聃琳

(1.长春工业大学 化学与生命科学学院， 吉林 长春 130012;2.长春工业大学 材料科学高等研究院， 吉林 长春 130012)

0 引 言

近年来，由病毒和细菌等微生物引起的健康问题频频出现，引起了人们的重视，研发新型、高效、无二次污染的抗菌材料成为当今研究热点之一[1-2]。

卤胺抗菌材料因其抗菌效果优异、稳定性高、无毒、廉价、可再生等特点，广泛用于医疗领域、食品包装、水净化系统等方面。卤胺化合物经过水解，N-Cl键转变成N-H键，释放出的Cl+具有强氧化性，可以破坏细胞基质，从而起到抗菌作用[3-4]。随后，将其用消毒水(有效成分为NaClO)进行氯化处理，N-H键又转变成N-Cl键，具有抗菌可再生性。对于卤胺化合物而言，其与细菌相接触的面积对抗菌效果起至关重要的作用。磁性纳米粒子因其具有小尺寸、较大比表面积、无毒、可进行磁性回收等特点，广泛用于抗菌纳米复合材料的制备当中[5-6]。

季铵盐类抗菌剂，尤其是高分子季铵盐带有丰富的正电荷，可以与带负电荷的细菌相互作用，并破坏细胞质膜，导致渗透，从而起到抗菌作用。高分子季铵盐因具有广谱、耐热性好、毒性低等优点，已成为抗菌领域的研究热点[7-8]。

本研究引入了聚乙烯亚胺(PEI)，其富含活性较高的氨基，将其接枝到Fe3O4@SiO2纳米粒子表面，并将本研究中合成的3-溴丙基-5,5-二甲基海因接枝到改性纳米粒子表面，将PEI季铵化，经过氯化处理得到季铵化卤胺聚合物改性Fe3O4@SiO2纳米粒子，成功地制备了一种协同季铵盐和卤胺抗菌机理的可回收的抗菌纳米复合材料。对氯化前后样品进行抗菌测试，探究其抗菌性能及抗菌机理。

1 实验部分

1.1 材料与设备

5，5-二甲基海因(98%)、1,3-二溴丙烷(99%)、硅酸四乙酯(>99%，GC)、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(97%)、聚乙烯亚胺(M=70 000)，上海麦克林生物生化科技有限公司；

氨水(25 wt%～28 wt%)、三氯化铁(99%)、碳酸钾、氢氧化钾，天津光复精细化工研究所；

乙二醇(AR)、无水乙酸钠、柠檬酸钠、甲醇(AR)、无水乙醇(AR)、次氯酸钠(AR)，北京化工厂。

核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司1H-NMR，AV-400；

透射电子显微镜(TEM),日本电子JEM-2000EX；

傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR),美国赛默飞世尔公司Thermo Fisher IS50；

Zeta电位分析仪,美国布鲁克海文仪器公司 90Plus Zeta；

振动样品磁强计(VSM),中国上海懿宏科学仪器有限公司Lake Shore 7404。

1.2 实验方法

1.2.1 3-溴丙基-5,5-二甲基海因的合成

按照文献[9]合成3-溴丙基-5,5-二甲基海因(BHD)，将3.2 g 5,5-二甲基海因(DMH，25 mmol)溶于120 mL丙酮当中，加入10 g无水碳酸钾(75 mmol)，冷凝回流1 h，再加入2.8 mL 1,3-二溴丙烷(27 mmol)，反应70 ℃回流12 h。待反应结束冷却至室温后，进行抽滤除去未反应的碳酸钾，收集滤液进行减压蒸馏而得到白色固体粗产品，再用柱层析法将该固体进行提纯(乙醇/环己烷=1/2-1/1)，最终得到白色固体即为目标化合物，产率为80%。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)：δ(×10-6)= 5.93(s，1H)，3.64(t,J=6.9 Hz,2H)，3.39(t，J=6.7 Hz)，2.22(m，2H)，1.43(s，6H)。

1.2.2 环氧官能团修饰的Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备

首先通过改进的水热法制备Fe3O4纳米粒子[10]。将1.08 g三氯化铁溶于20 mL乙二醇中，搅拌0.5 h后加入1.8 g无水乙酸钠再继续搅拌1 h，溶液变成澄清黄色，继续向上述反应加入0.25 g柠檬酸钠，待其形成均相分散液，转移至聚四氟乙烯反应釜中，200 ℃反应10 h。在外加磁场下将磁性纳米粒子分离出来，用去离子水和乙醇冲洗后离心，重复几次，放入60 ℃真空烘箱中干燥。

通过溶胶-凝胶法制备Fe3O4@SiO2纳米粒子[11]。取0.2 g新制备的Fe3O4纳米粒子，20 mL蒸馏水，80 mL乙醇，2 mL氨水置于250 mL的三口圆底烧瓶中，机械搅拌30 min，将5 mL硅酸四乙酯加入20 mL乙醇中，然后将混合液逐滴滴加到上述反应中，继续室温搅拌12 h。待反应结束，磁性分离出Fe3O4@SiO2纳米粒子，用去离子水和乙醇冲洗并离心，重复几次，真空干燥。

将0.5 g Fe3O4@SiO2加到0.1 mL γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)和40 mL乙醇的混合液当中，40 ℃回流12 h。用去离子水和乙醇冲洗几次除去未反应的KH560，放入真空烘箱中干燥，记为Fe3O4@SiO2-KH560。

1.2.3 季铵化卤胺聚合物改性Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备

将一定量Fe3O4@SiO2-KH560分散到甲醇当中，按照质量比4∶1加入聚乙烯亚胺(PEI)，于3 ℃反应7 h。改性纳米粒子表面的环氧官能团与PEI上的伯氨和仲胺基发生开环反应，这个过程就是PEI的叔胺化过程。反应结束，用水和乙醇进行冲洗，多反复几次，再真空烘干，得到Fe3O4@SiO2-PEI纳米粒子。

称取0.1 g BHD固体，将其溶于50 mL甲醇当中，待升温至60 ℃再加入0.5 g Fe3O4@SiO2-PEI纳米粒子，继续反应24 h。在这个反应过程中，BHD与纳米粒子表面PEI的叔胺位进行取代反应，即为PEI的季铵化过程。待反应结束后，用去离子水和乙醇冲洗，放入真空烘箱干燥一夜，得到Fe3O4@SiO2-QPEI纳米粒子。

将0.5 g Fe3O4@SiO2-QPEI加入30 mL次氯酸钠溶液(30 wt%)中，机械搅拌12 h，用水和乙醇冲洗3次，60 ℃真空干燥一夜得到季铵化卤胺聚合物改性纳米粒子，记为Fe3O4@SiO2-QPC。

1.3 有效氯含量的测定

按照硫代硫酸钠-碘量法滴定，测得有效氯的含量[12]。取一定量Fe3O4@SiO2-QPC抗菌纳米粒子于锥形瓶中，加入一定量去离子水、碘化钾以及淀粉溶液。KI中I-会被纳米粒子表面Cl+还原成I2，此时溶液显蓝色。用已知浓度的硫代硫酸钠标准溶液去滴定上述溶液，其有还原性，会将I2还原成I-，蓝色消失即达到滴定终点。重复3次，进行平行滴定。

有效氯的含量

(1)

式中：N----滴定所消耗的硫代硫酸钠的当量浓度,N；

V----滴定所消耗的硫代硫酸钠的体积,L；

W----滴定所使用样品的质量,g。

1.4 抗菌性能测试

选用金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC25922)作为指示菌，用最小抑菌浓度法对粉末样品进行抗菌性能的表征。先把样品进行灭菌处理，然后将其配制成一系列的不同梯度的浓度，再把已知浓度的样品倒至一定量浓度的菌液之中，以37 ℃进行恒温震荡培养，通过观察其浑浊度的变化来判断细菌是否增殖，当不出现增殖现象的时候，所使用的浓度就是样品的最小抑菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 结构分析

BHD的1H-NMR谱图如图1所示。

图1 BHD的1H-NMR谱图

由图1可以看出，5.93×10-6处为海因环N-H上的氢原子，3.64×10-6和3.39×10-6处为烷基取代链上靠近海因环一侧和靠近Br一侧-CH2-上的氢原子，2.22×10-6处为烷基链最中间-CH2-上的氢原子，1.43×10-6处为海因环两个-CH3上的氢原子。该1H-NMR谱图中的化学位移、峰面积以及峰型都吻合BHD的化学结构。说明了目标化合物3-溴丙基-5,5-二甲基海因的成功制备。

2.2 TEM分析

对Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC纳米粒子进行形貌分析，其透射电子显微镜图片如图2所示。

(a) Fe3O4

(b) Fe3O4@SiO2

(c) Fe3O4@SiO2-QPC图2 TEM图片

由图2(a)可以看出，Fe3O4出现团聚现象，直径约为96 nm。图2(b)中能够明显看出，Fe3O4@SiO2具有核壳结构，SiO2壳成功地包覆在Fe3O4核的表面，该纳米粒子分散均匀，粒径大小相对均匀，直径约为125 nm，外部SiO2壳层厚度约为14.5 nm。图2(c)可知，Fe3O4@SiO2-QPC直径约为153 nm，其壳外表面粗糙，为聚合物壳层，厚度约为9 nm。

2.3 FT-IR分析

对样品进行了红外测试，采用溴化钾压片法，KBr为光谱纯，结果如图3所示。

图3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC的FT-IR谱图

由图3曲线a可以看出，在589 cm-1处是Fe-O的特征吸收峰。曲线b可以看出，除了有Fe-O 特征吸收峰之外，还多出现了3个强峰，在1 100 cm-1和840 cm-1处归属于Si-O-Si键的对称和不对称伸缩振动吸收峰，而在950 cm-1处是Si-OH的伸缩振动峰。这个结果表明SiO2壳层成功地包覆在核Fe3O4纳米粒子的表面。曲线c可以看出，除了以上特征吸收峰外，在1 700 cm-1处出现一个峰，这个峰是海因环上C=O的特征吸收峰。这个结果表明BHD成功地接枝到了Fe3O4@SiO2-PEI表面。曲线d可以看出，Fe3O4@SiO2-QPC的FT-IR谱图上，由于氯化作用N-H转变为N-Cl，破坏了原来的N-H…O-C氢键，原来1 700 cm-1处的C=O偏移到了1 680 cm-1，此结果与文献报道相一致[13]。红外分析结果说明，成功制备了季铵化卤胺聚合物改性Fe3O4@SiO2抗菌纳米粒子。

2.4 Zeta电位分析

用Zeta电位分析仪测试了样品的Zeta电位，结果如图4所示。

图4 Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-PEI和Fe3O4@SiO2-QPC的Zeta电位

由图4可以看出，Fe3O4@SiO2的Zeta电位是-22.31 mV，这是由于SiO2表面富含羟基，在水溶液中呈现负电性，测试结果与其相符。Fe3O4@SiO2-PEI的Zeta电位为+30.12 mV，因为Fe3O4@SiO2经过PEI修饰表面富含氨基，在水溶液呈正电性，测试结果与之相吻合。而Fe3O4@SiO2-QPC的Zeta电位为+38.95 mV，这是因为将纳米粒子季铵化之后，季氮原子呈正性，材料表面正电荷增多。电位分析结果也说明了本研究中季铵化卤胺聚合物改性Fe3O4@SiO2纳米粒子的成功制备。

2.5 磁性能分析

在室温下测试样品的磁性能，磁滞回曲线如图5所示。

图5 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC(c)的磁滞回曲线

图5中，右下角插图为样品分散在水中，能用磁铁快速回收的图片。

Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-QPC的饱和磁化强度分别为73.9、32.4、25.7 emu/g，包覆壳层之后使得样品的磁化强度减弱。从图5可以看出，磁滞回曲线经过原点呈现出标准的S形，剩磁几乎为0，即样品在外加磁场消失之后磁性也消失，说明样品具有超顺磁性。这在磁分离以及再分散方面有着极大的优势，如图5中右下角的插图所示。将一定量季铵化卤胺聚合物改性Fe3O4@SiO2纳米粒子分散于水中，使用磁铁施加外加磁场，纳米粒子迅速向磁铁方向移动，20 s就能实现全部回收。并且在撤销磁铁之后，摇晃瓶子，样品又能够快速又均匀地重新分散在水之中。

2.6 抗菌性能分析

抗菌实验以氯化前后的样品Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC作为对照实验，最小抑菌浓度法的结果见表1。

表1 最小抑菌浓度法对样品进行抗菌测试的结果

未经氯化的样品Fe3O4@SiO2-QPEI对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为256 μg/mL和512 μg/mL。经过氯化作用之后的样品Fe3O4@SiO2-QPC对葡萄球菌和大肠杆菌最小抑菌浓度分别为32 μg/mL和64 μg/mL。氯化之后的样品比未氯化的样品的最小抑菌浓度要低，说明氯化之后抗菌效果要好。

为了进一步考察样品的抗菌效果，又对氯化前后的样品Fe3O4@SiO2-QPEI和Fe3O4@SiO2-QPC进行了抗菌动力学实验，结果见表2。

表2 对样品进行抗菌动力学测试的结果

注：a为细菌浓度7.61×105CFU/样品； b为细菌浓度1.02×106CFU/样品。

未氯化的样品Fe3O4@SiO2-QPEI在30 min内对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的对数减少值都有所降低，这是由于Fe3O4@SiO2-QPEI抗菌是由纳米粒子表面季铵盐的季氮原子起作用，其带正电荷，而细菌表面带负电荷，抗菌纳米粒子会吸附到细菌的表面，与其接触，使蛋白质变性或者破坏细胞膜的结构，从而达到抗菌的作用。氯化之后的样品Fe3O4@SiO2-QPC能够在30 min内杀死100%的两种细菌，其抗菌是协同季铵盐抗菌及N-卤胺抗菌机理，在季氮原子正电荷起作用的同时，N-卤胺中N-Cl键水解，释放出的Cl+具有强氧化作用，可破坏细胞膜结构,从而导致细胞失活。由表2还可以看出，二者对金黄色葡萄球菌的抗菌效果都比大肠杆菌好。这是由于大肠杆菌是典型的革兰氏阴性菌，与革兰氏阳性菌黄色葡萄球菌相比，除了有一层细胞壁之外，还有一层细胞外膜，不利于抗菌剂向细胞壁接近，所以，季铵化卤胺聚合物改性Fe3O4@SiO2纳米粒子对革兰氏阳性菌的抗菌效果要优于革兰氏阴性菌。

3 结 语

本实验成功制备了Fe3O4@SiO2-QPC纳米粒子，1H-NMR表明了小分子BHD的成功合成，利用FT-IR和TEM对样品进行结构和形貌表征，表明聚合物成功接枝在Fe3O4@SiO2表面，纳米粒子有明显的核壳结构。通过磁性测试证明了样品可以通过外加磁场实现回收，可对样品重新氯化反复使用。以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌进行抗菌测试，结果表明，Fe3O4@SiO2-QPC纳米粒子能够协同季铵盐及卤胺抗菌机理，30 min内能使全部细菌失去活性，比未氯化样品Fe3O4@SiO2-QPEI抗菌效果好。