棉酚渣对尿素水解及土壤氨挥发的影响

陈 敏，李高生，冼建鸿，王 炜，阎 晶，董倩雯，卢其明*

（1．华南农业大学公共基础课实验教学中心，广东 广州 510642；2．华南农业大学材料与能源学院，广东 广州 510642）

尿素是目前世界农业生产中应用最广泛、使用量最大的肥料品种，是土壤肥力的主要来源之一［1］。尿素施入土壤后，只有少量以分子态的形式被土壤胶体吸附，而绝大部分被土壤中的脲酶催化迅速水解为碳酸铵，容易造成氨挥发、硝化-反硝化等途径的损失，导致尿素的利用率低［2］。脲酶是土壤微生物体内与氨转化密切相关的一种水解酶，广泛存在于植物、细菌、真菌、藻类和无脊椎动物中，脲酶活性强弱直接影响土壤氨挥发损失［3-4］。在尿素中添加脲酶抑制剂能够抑制土壤脲酶的活性，抑制脲酶对尿素的水解作用，减缓尿素向铵态氮转化，抑制氨的挥发，从而提高尿素的利用率，对提高作物产量、保护环境等方面起到了积极作用［5-7］。

现今国内外发现的脲酶抑制剂主要有重金属盐类、酚醌类、磷胺类和杂环类等，但在众多种类的脲酶抑制剂当中，很难找到廉价、低毒、无污染的脲酶抑制剂。N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）是目前使用较广泛且增长速度最快的脲酶抑制剂［8］，但其价格较高，且人们对其安全性仍存疑虑。所以，研制新型的高效脲酶抑制剂将会是今后的重要研究方向之一［9］。

我国是产棉大国，绝大部分棉花品种的棉仁、棉根皮中棉酚含量很高，目前除少量作为避孕药物外，绝大部分作为有害物质去除，未得到有效利用。有研究显示，棉酚及其衍生物对土壤脲酶活性具有一定的抑制作用，为废弃棉酚的利用提供了有效途径［10-12］。近年棉籽加工使用溶剂萃取法逐步增多，主要工艺是先将棉仁用溶剂汽油萃取出棉籽油，再用甲醇萃取出棉酚。甲醇萃取液中富含棉酚和被甲醇溶解的有机物，在蒸发回收甲醇的过程中产生大量棉酚渣。棉酚渣中除含有棉酚及其二聚、三聚产物和各种衍生物外，还含糖类、游离脂肪酸等，成份复杂。除了棉酚，棉酚渣中的其他各种有机物对尿素水解及氨挥发也会产生不同程度的影响［13］。本文以棉酚渣为添加剂，通过实验室模拟探究棉酚渣对尿素水解及氨挥发的影响，为利用棉籽加工废弃物提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自广州五山华南农业大学树木园内，为红壤，基本理化性质：有机质含量为19.1～37.5 g/kg，全氮含量为0.87～1.58 g/kg，全磷含量为0.61～0.64 g/kg，pH值为5.0～5.5。土壤采集后铺平风干，过0.15 mm筛，装袋备用。

供试棉酚渣为中棉紫光棉籽加工工艺的残渣：先用己烷为主要成份的溶剂浸出棉籽油，再用85%甲醇水溶液提取棉酚，通过薄膜蒸发甲醇提取液后的残余物即为棉酚渣。

1.2 主要仪器和试剂

TDZ5-WS型医用离心机，QYC型全温控空气摇床，7200型可见分光光度计，所用试剂均为市售分析纯试剂。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂的配制

测试尿素残留差异率（二乙酰一肟法）［14］：（1）二乙酰一肟（DAM）溶液：称取2.50 g二乙酰一肟溶于50 mL烧杯中，搅拌直到完全溶解，定容100 mL；（2）氨基硫脲（TSC）溶液：称取0.25 g氨基硫脲溶于50 mL烧杯中，搅拌直到完全溶解，定容100 mL；（3）混酸溶液：在500 mL烧杯中加入100 mL水，缓慢加入85%磷酸300 mL和98%浓硫酸10 mL，在冰水浴中缓慢搅拌，定容500 mL；（4）显色剂：量取25 mL二乙酰一肟溶液和10.0 mL氨基硫脲溶液，加入至500 mL混酸溶液中，摇晃使其均匀，现配现用；（5）缓冲液：称取22.25 g磷酸氢二钠和17.00 g磷酸二氢钾于装有800 mL水的烧杯中，定容至2 L，摇晃均匀；（6）10%尿素溶液：尿素与水按质量比1∶9混合均匀，称取50℃烘箱干燥后的尿素50.0 g溶于450 mL水中，装于500 mL试剂瓶中备用。

测试氨挥发量［15］：（1）2%硼酸溶液：称取6.00 g硼酸置于1 000 mL烧杯中，加入294 mL蒸馏水溶解备用；（2）1%甲基红溶液：称取0.50 g甲基红溶于50 mL无水乙醇中，装于棕色瓶内备用；（3）1%溴甲酚绿溶液：称取0.50 g溴甲酚绿溶于50 mL无水乙醇中，装于棕色瓶内备用；（4）混合指示剂：溴甲酚绿-甲基红，体积比3∶2。

1.3.2 尿素水解抑制试验

将一定量棉酚渣与10.0 g风干土放入250 mL锥形瓶中，混合均匀，加入50 mL缓冲液和10.0 mL 10%尿素溶液，摇匀。放入设定好温度的全温控空气摇床中培养。一段时间后取出锥形瓶，对溶液进行离心。将离心后的溶液定容至250 mL。用移液枪取1.00 mL溶液到50 mL容量瓶内，加30 mL显色剂，轻摇容量瓶2 s后放入沸水浴中加热30 min，然后立即在流动的自来水中降温15 min，再用水定容至50 mL。用分光光度计在520 nm波长处测定吸光度，进行尿素残留量检测，计算尿素残留差异率。

式中：R为添加棉酚渣的土壤尿素剩余量，R0为未添加棉酚渣的土壤尿素剩余量。

1.3.3 土壤氨挥发抑制试验

将40.0 g过筛后的土壤与一定量的棉酚渣混匀，放入1 L广口瓶中，加入4.00 g尿素固体，摇匀；将装有20 mL含2%硼酸溶液及酸碱指示剂（2～3滴）吸收液的无盖称量瓶放入广口瓶中，密封广口瓶，置于培养箱中培养。24 h后取出，用硫酸标准滴定溶液滴定至终点，记录所需硫酸体积。在不考虑气体扩散速率和溶液吸收速率不同的情况下，可认为氨气的释放量与滴定所需的硫酸体积成正比，检测氨气的吸收量，计算氨挥发抑制率。所用装置如图1所示。

式中：n0为未加棉酚渣的土壤氨气释放量，n为添加棉酚渣的土壤氨气释放量。

图1 氨气吸收装置示意图

1.4 数据统计分析

采用Origin 8.6软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 棉酚渣施用量对尿素水解和氨挥发量的影响

2.1.1 棉酚渣施用量对尿素水解的影响

35℃条件下，设定棉酚渣用量分别为0、6、8、10、12 g，其中用量0 g为对照，比较不同棉酚渣用量对土壤脲酶活性的抑制效果。缓冲液加入量为50 mL，10%尿素用量为10 mL；每组分成5批次分别于2、4、6、8、12 d取出，测定尿素剩余量，结果见图2。

图2 棉酚渣施用量对尿素水解的影响

从图2中曲线可以看出，随着培养时间的延长，试验组和对照组的尿素剩余量均逐渐减少，不同棉酚渣用量在4～8 d时段内尿素剩余量差异明显。在2和12 d时，由于尿素残留量太多或太少而差异不明显。如果用尿素残留差异率分析，在第4 d时试验组的尿素残留差异率都达到了试验期间的最大值，6～12 g棉酚渣用量的试验组的尿素残留差异率在67.02%～78.81%。整体上来看，棉酚渣的加入对尿素水解有明显的抑制作用，且在培养4～8 d期间能够有效抑制尿素水解。

2.1.2 棉酚渣施用量对土壤氨挥发的影响

在温度35℃，风干土40.0 g，加水量为10 mL的条件下，比较不同棉酚渣用量（0、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 g）对土壤氨挥发的影响。由图3可知，随着棉酚渣施用量的增加，氨气检测量逐渐减少，表明氨挥发量减少。由图4可知，氨挥发抑制率逐渐升高，在棉酚渣用量为2.0 g时，氨挥发抑制率达到80.40%。棉酚渣能有效降低土壤氨挥发量，并且抑制效果随着棉酚渣施用量的增加而增强。除了棉酚渣抑制尿素水解的原因外，可能加入棉酚渣对NH4+具有吸附作用或对水解后的土壤溶液pH变化具有缓冲作用。

2.2 土壤含水量变化对棉酚渣抑制尿素水解及土壤氨挥发的影响

2.2.1 加水量对棉酚渣抑制尿素水解的影响

分别加0、5、10、30、50 mL缓冲液于10.0 g风干土中，各自再加入10.0 g棉酚渣，10%尿素溶液10 mL，培养温度为35℃，培养2 d后取出测定剩余尿素量，以不加棉酚渣的处理为对照组，结果如图5。

图3 棉酚渣施用量对氨气挥发量的影响

图4 棉酚渣施用量对氨挥发的抑制率的影响

图5 缓冲液加入量对尿素水解的影响

由图5可知，在全部缓冲液加入量范围内，水土比依次为1.0、1.5、2.0、4.0、6.0（包括尿素溶液加入的水分），棉酚渣对尿素水解均显示有较强的抑制作用，差异较小。但随着缓冲液加入量的增加，无论有无棉酚渣，尿素残余量均出现先降后升的趋势，即尿素的水解量呈现先上升后下降的变化趋势。可能加入一定量的缓冲液，严格控制土壤pH值，有利于脲酶发挥作用。但随着缓冲液用量的继续增加（水土比为2.0以上），由于水对尿素和脲酶的稀释作用，尿素的剩余量逐渐增加。

2.2.2 加水量对棉酚渣抑制土壤氨挥发的影响

分别加水0、5、10、15、20、25、30 mL于40.0 g风干土壤中，土壤含水率分别为3.5%、14.2%、22.8%、29.8%、35.0%、40.6%、44.9%（湿基），在棉酚渣用量0.40 g的条件下，考察不同加水量对棉酚渣抑制土壤氨挥发的影响。

从图6可以看出，随加水量的增大，氨气检测量先增加后减少，在加水量10 mL（土壤含水量22.8%）时，氨气检测量最大。加水量增大可能增强脲酶活性和产酶微生物的活性，但继续增加土壤含水量会导致水解产生的NH4+（或 NH3）溶解在土壤溶液中而减少挥发。棉酚渣的抑制作用显示在图7中，加水量少时可能由于脲酶活性低或棉酚渣分散较差的原因，并无明显的抑制作用，随着加水量的增加（土壤含水量22.8%以上），棉酚渣对氨挥发的抑制率增大，达到45%以上。

图6 加水量对氨气挥发量的影响

图7 加水量对氨挥发抑制率的影响

2.3 培养温度对棉酚渣抑制尿素水解及土壤氨挥发的影响

2.3.1 培养温度对棉酚渣抑制尿素水解的影响

在10.0 g棉酚渣的使用量保持不变的情况下，探究不同培养温度对棉酚渣抑制尿素水解的影响。设置20、25、30、35、40℃5个处理，每个处理均设置不添加棉酚渣的对照。向锥形瓶中依次加入10.0 g风干土，50 mL缓冲液，10%尿素溶液10 mL（水土比6.0），培养2 d后，取出样品测定尿素剩余含量，计算尿素残留差异率，如图8所示。

图8 培养温度对尿素残留差异率的影响

随着培养温度的升高，尿素残留差异率逐渐增加，培养温度为35℃时，尿素残留差异率达到最大，达到了79.72%；当培养温度继续升高至40℃后，尿素残留差异率仍有76.62%。培养温度降低时尿素残留迅速下降，在20℃时只有23.83%。因此，棉酚渣的加入能够有效减缓尿素的水解，在高温段尿素水解加快，棉酚渣的作用突显。

2.3.2 培养温度对棉酚渣抑制土壤氨挥发的影响

在棉酚渣用量0.40 g，加水量为10 mL的条件下，考察不同培养温度（20、25、30、35、40℃）对棉酚渣抑制土壤氨挥发的影响，结果如图9、图10所示。

由图9可知，随着培养温度的升高，氨气的释放量逐渐增加，表明氨气的挥发量受温度的影响较大，温度升高促进氨的挥发。由图10可知，棉酚渣对土壤氨挥发的抑制率呈现先上升后下降的趋势，在30℃时棉酚渣对土壤氨挥发的抑制率最大，达到55.34%，而其它温度时的氨挥发的抑制率在36.67%～44.97%。从抑制率的角度看，在适宜的温度下效果明显，可能是在产酶菌活性高的条件下，棉酚渣对土壤氨挥发表现出较强的抑制作用。

图9 培养温度对氨气挥发量的影响

图10 培养温度对氨挥发抑制率的影响

3 结论与讨论

棉酚渣中除了棉酚及其聚合物、衍生物外，还有糖类、游离脂肪酸等有机物，棉酚及其部分衍生物对土壤脲酶有较强的抑制作用［12］，其他有机物也可能有类似腐植酸的抑制作用［13］。另一方面，有机物有可能成为产酶微生物的营养物质，有利于微生物的繁殖。在本试验范围内，棉酚渣的存在对尿素水解及土壤氨挥发显示较强的抑制作用，可视为抑制作用占主导。

土壤的含水量的变化，对棉酚渣抑制尿素水解作用的影响不明显，但对棉酚渣抑制氨挥发的影响大。随着土壤含水量的增加，棉酚渣对土壤氨挥发的抑制率逐渐增大。在土壤含水率22.8%以上时，棉酚渣对氨挥发的抑制剂达45%以上。由于溶解的原因，土壤含水率大时氨挥发量较小，对棉酚渣的抑制效果有所掩盖。

温度的变化对脲酶活性的影响较大，对土壤产酶菌的影响也很大，从而影响了棉酚渣的使用效果。在适宜的温度下棉酚渣对尿素水解的抑制效果比较明显，但高温下氨易挥发，掩盖了棉酚渣的抑制效果。棉酚渣的脲酶抑制作用可能和大多脲酶抑制剂一样属于混合性抑制［11，16］，抑制机理有待进一步研究。

整体来看，棉酚渣对尿素水解及土壤氨挥发具有一定抑制作用，但还需要进一步通过盆栽试验和田间试验对其抑制效果进行综合评价。