3D打印聚己内酯多级管道支架促进梗死后心肌修复

研究表明，心肌补片移植于心肌梗死部位可以为心肌梗死区域提供良好的力学支持，改善心肌梗死后心脏左室重构，减少心肌凋亡，进而改善心功能[1-3]。大多数相关研究集中在心肌补片良好的力学性质上，而忽略其在促血管化方面的作用，而心肌再血管化对梗死后处于缺血的心肌细胞功能的恢复非常关键[4]。近年来，3D打印技术在心肌补片支架领域应用广泛，可精准设计特定的结构促进移植区域的血管化，故心肌补片在促血管化方面有很好的应用前景[5-6]。本研究中，我们通过3D打印技术，以蔗糖和聚已内酯(PCL)为材料，制备多级管道支架，移植于SD大鼠心肌梗死区域，探讨其对SD大鼠心肌梗死后再血管化作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体质量为200～250 g，由上海交通大学医学院实验动物科学部提供，动物生产许可证号为 SCXK(沪)2018-0006，使用许可证号为：SYXK(沪)2013-0050，将动物饲养在12 h光照、黑暗交替，恒湿恒温环境下。

1.2 主要试剂和仪器

CD31抗体(1∶100，美国Abcam)；α-SMA抗体(1∶200，美国 Abcam )；DAPI(美国Vector)；Alexa Fluor 594荧光二抗(1∶1000，美国Thermo Scientific)；Alexa Fluor 488荧光二抗(1∶200，美国Thermo Scientific)；小动物人工呼吸机(DW-3000A/B，北京众实迪创科技发展有限责任公司)；共聚焦激光扫描显微镜(LSM-710，德国Zeiss)；PCL(80 000 g/mol，美国Sigma)；六氟异丙醇(HFIP，上海达瑞精细化工)；食用蔗糖(市售)；CD31抗体(1∶100，美国Abcam)；α-SMA抗体(1∶200，美国 Abcam)；DAPI(美国 Vector)；Alexa Fluor 594荧光二抗(1∶1000，美国Thermo Scientific)；Alexa Fluor 488荧光二抗(1∶200，美国Thermo Scientific)；扫描电子显微镜(SEM, JSM-5600LV，日本JEOL)；力学试验机(Exceed 40，美国MTS)小动物人工呼吸机(DW-3000A/B，北京众实迪创科技发展有限责任公司)；共聚焦激光扫描显微镜(LSM-710，德国Zeiss)。

1.3 3D打印PCL多级管道支架

以市售蔗糖作为原料，在熔融沉积成型(FDM)打印机中加热1 h，焦糖化处理后作为打印墨水；并进一步通过3D打印制备焦糖化模板，打印温度为135 ℃。将4%的PCL/HFIP溶液，通过溶剂浇铸法在模板表面形成涂层，然后通过牺牲模板法将焦糖化模板去除，经过冷冻干燥后获得PCL多级管道支架。将含有PCL涂层的蔗糖支架放置在载玻片上，在载玻片上滴加适量蒸馏水，使支架的一侧与蒸馏水接触，用显微镜观察并视频记录蔗糖溶解的过程。通过SEM和力学试验机表征PCL多级管道支架的结构和力学参数。将PCL支架浸渍红色染料溶液，观察染液在管道中分布情况。

1.4 急性心肌梗死模型构建及支架体内移植

2%戊巴比妥(30 mg/kg)对SD大鼠进行腹腔麻醉后，将大鼠固定于手术台，行气管插管，小动物呼吸机维持其呼吸。胸部去毛并消毒铺巾，于左侧第4～5肋间隙打开胸腔，打开心包，暴露SD大鼠心脏，6-0聚丙烯缝线于左心耳前下部约3～4 mm 处缝合，结扎左冠状动脉前降支(LAD)，结扎后可观察到心尖部及前壁心肌组织出现苍白色，前壁收缩运动减弱。关闭胸腔并缝合皮肤，将SD大鼠送回动物房饲养。Sham组SD大鼠仅开胸，不结扎LAD。术后2 d行超声检查确定基线，筛选出射血分数为40%～45%的SD大鼠16只，随机分成2组，分别为MI组(n=8)和MI+scaffold组(n=8)。MI+scaffold组进行二次开胸，用6-0聚丙烯缝线将补片缝合于心脏表面，补片覆盖梗死区域，Sham组和MI组仅二次开胸，关闭胸腔，缝合后将SD大鼠送回动物房饲养。

1.5 石蜡包埋及Masson染色

术后28 d取材SD大鼠心肌组织，浸于4%多聚甲醛固定24 h。将固定好的心肌组织置入不同浓度的酒精中脱水(75% 4 h、85% 2 h、90% 2 h、95% 1 h、100% 1 h)，将脱水的心肌组织石蜡包埋，于石蜡切片机上连续切片，每层5 μm，摊片，60 ℃烘烤后室温保存备用。将切片先用Weigert氏铁苏木素染5 min，自来水洗后，以1 %的盐酸酒精分化数秒，流水冲洗数分钟后返蓝。以丽春红酸性品红液染5～10 min后，蒸馏水快速漂洗，最后磷钼酸水溶液处理3～5 min，苯胺蓝液复染5 min。将染好的切片置于1%冰醋酸处理1 min，脱水封片，显微镜镜检观察。

1.6 免疫荧光染色

将组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液的高压锅内进行抗原修复。冷却后用PBS清洗甩干，加入自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min。在切片上滴加一抗(CD31抗体+α-SMA抗体)，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜；玻片置于PBS中洗涤3次，每次5 min，稍甩干后滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50 min；玻片置于PBS中洗涤3次，每次5 min，稍甩干后滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min，封片后于共聚焦激光扫描显微镜下观察并采集图片，每个区域取3个视野，取平均值。

1.7 统计学分析

计量数据采用均数±标准差表示，采用 SPSS 24.0 软件进行统计分析，两组间比较采用独立样本t检验，3组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3D打印PCL多级管道支架

3D打印机需要设定的主要参数有打印温度和打印速率，参数的设定关系到模板打印能否成功和成品支架的形态。图1A显示焦糖墨水可以在高温下被顺利挤出形成纤维，并在3D打印机的控制下进行排列，温度降低后焦糖墨水很快凝固，所打印的形状能很好保持。如图1B所示，3D打印的蔗糖模板具有精细的三维结构，为直径400～600 μm的焦糖丝连续均匀地堆积而成，层与层之间晶丝交叉粘接形成整体。

图1C展示了管道内部相互连通，提供管道之间的物质运输通道，这种多级管道结构模拟了血管在组织中的运输功能。采用4%PCL浇筑法能够制得厚度适中、均匀完整的三维支架(见图1D)。支架管路排列整齐，分布均匀，纵横交错。图1E～1G显示，由于蒸馏水滴加于支架一侧，支架的溶解从接触蒸馏水一侧开始，并逐渐向另一侧发展。随着溶解时间的增长，蒸馏水与蔗糖之间的固液界面不断向支架内部推移。可以观察到蔗糖已溶解的部分呈白色管状支架，而蔗糖未溶解的支架部分呈浅黄色，蔗糖支架内的气泡也随着溶解向外部迁移。上层支架内蔗糖溶解的同时，下层支架内的蔗糖也在溶解，当所有蔗糖全部溶解时，支架所形成的孔道结构与原有的模板形态结构完全一致。

图1 PCL多层管道支架制作过程及结构特点(标尺为500 μm)

2.2 PCL多级管道支架缩小SD大鼠梗死面积及瘢痕面积

术后28 d收集各组SD大鼠心脏组织，进行Masson染色，每组8个样本。3组切面Masson染色整体及局部代表图见图2。Sham组心肌组织无明显的纤维化；MI组术后28 d梗死区域纤维化明显, 梗死范围比例为(64.63±7.72)%，瘢痕面积为(13.85±1.98)mm2；MI+scaffold组梗死区域纤维化较MI组少，梗死范围为(42.01±8.68)%，瘢痕面积为(9.82±1.47)mm2，与MI组相比均存在明显差异(P<0.01)。

2.3 PCL多级管道支架促进心肌再血管化

图3中A和B分别表示MI组和MI+scaffold组心肌梗死交界区血管再生情况，绿色荧光代表α-SMA，标记平滑肌细胞，红色荧光代表CD31，标记血管内皮细胞，蓝色荧光代表DAPI，标记细胞核。对比两者结果发现，MI+scaffold组梗死交界区新生血管密度为(15±3.13)个/HPF，而MI组梗死交界区新生血管密度为(5.29±0.91)个/HPF，两组差异有统计学意义(P<0.01)，说明PCL多级管道支架对梗死交界区具有较强的促血管化的能力。图3表示MI+scaffold组支架内血管再生情况。PCL多级管道支架内部的新生血管密度为(17.7±2.71)个/HPF，与另两组相比差异有统计学意义(P<0.05)，说明PCL多级管道支架具有良好的生物相容性，并具有促血管再生的能力。

图2 术后28 d心肌组织Masson染色

注：A为MI组梗死交界区；B为MI+scaffold组梗死交界区；C为MI+scaffold组支架内部

3 讨论

我们通过3D打印技术，成功制备PCL多级管道支架，并移植于SD大鼠梗死心肌表面，发现其可缩小心肌梗死范围和瘢痕区域，并促进交界区域的再血管化，从而修复梗死后的心肌。

目前，心肌补片支架因其在力学性能上的优越性，在梗死后心肌修复方面取得了较好的成果[7]。然而，大多研究主要关注补片支架的力学性能，在其生物相容性和促血管化方面仍然面临很大的挑战[8]。3D打印技术能准确设计和调控支架结构，在心肌补片支架方面应用广泛。

本研究采用3D打印构筑三维结构仿生血管网络。受限于现有设备的精度和材料流动加工过程中的变形性，3D打印技术尚无法直接打印薄壁血管网络结构，因此采取间接倒模的方式来制备血管网络支架。利用间接倒模法制备三维支架已经取得一定的成果，但仍然面临一定的挑战，包括材料的选择、三维支架结构的稳定性、生物相容性及可降解性[9-10]。我们选择食用级的蔗糖作为原料，利用熔融层积成型技术打印支架的模板。模板的形态结构可以通过3D打印实现宏观和微观层面上个性化的定制。焦糖化的蔗糖具有诸多优点：良好的生物相容性、原料的易得性、适宜的熔点、熔融状态下良好的流动性和降温时快速的固化成型性。采用液浇铸和模板浸出法，将生物材料制备成三维连通的管状网络支架，并通过调控相分离在支架管道壁上形成均匀分布的微纳米级的开放孔，模拟天然血管壁的通透性，保证氧气和营养物质能够通过管壁，使仿生血管网具备类似血管壁的物质交换功能。该巧妙的多级管道结构有利于血管的生长。

心脏发生心肌梗死后，随着病情的进展，心脏左室发生不良的左室重构，即心脏左室扩大，胶原纤维沉积，瘢痕形成，最终导致心力衰竭，故逆转不良的左室重构对于梗死后心肌修复至关重要[11]。本研究中我们发现，PCL多级管道支架移植于SD大鼠梗死心肌表面28 d后，MI+scaffold组梗死范围和瘢痕区域明显小于MI组，说明PCL多级管道支架在一定程度上能促进心肌修复。心肌再血管化在心肌修复中起重要作用，早期再血管化有助于梗死交界区处于缺血的心肌获得足够的血供，防止其因长期的缺血而导致凋亡[12]。本研究中，PCL多级管道支架中长入大量的新生血管，同时梗死交界区也有大量的新生血管，为处于缺血的心肌细胞提供了良好的血供，减少梗死交界区心肌细胞的凋亡，故最终可缩小梗死范围和瘢痕面积，这与组织学结果相符。

我们通过3D打印技术成功制备PCL多级管道支架，经动物实验证实可促进梗死心肌再血管化，缩小梗死范围和梗死面积，达到修复心肌的作用。