星点设计-效应面法优化芹菜籽挥发油羟丙基-β-环糊精的包合工艺*

刘道群，国大亮，赵 宇，刘 岩，宋秀宁，刘玉璇

（1．天津中医药大学，天津 301617；2．天津达仁堂京万红药业有限公司，天津 300112）

芹菜籽为伞形科植物旱芹（Apium graveolens L．）的干燥成熟果实[1]。芹菜籽在维吾尔医药中广泛应用，具有消除寒湿闭阴，消食健胃，消肿散气，消石止痛，调和百药等功效[2]，是新疆资源丰富的药食兼用植物资源。芹菜籽中的挥发油是芹菜籽中的重要成分，具有抗氧化[3]、降低亚硝酸钠活性[4-5]、降低血液黏度[6]、抗脑缺血[7]、降血压[8]等药理作用。同时其具有清新的香气，可用于食品、化妆品等行业[9-10]。芹菜籽挥发油中的主要药效成分为丁苯酞。丁苯酞可用于治疗帕金森症、阿尔兹海默病、血管性痴呆、抑郁症、惊厥、癫痫等中枢神经系统疾病，同时可以用于心血管系统疾病，对某些糖尿病及高血压并发症具有一定的疗效[11-16]。目前上市的国家一类新药丁苯酞软胶囊，临床上主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中。

在制剂过程中，挥发油处理的常规方式为直接喷洒，但是挥发油性质不稳定，对光、热、空气敏感，在制剂中易损失，为提高芹菜籽挥发油的稳定性和水溶性，减小刺激性，本研究采用羟丙基-β-环糊精包合芹菜籽挥发油，并采用星点设计效应面法对包合工艺进行优化。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SSI型高效液相色谱仪（美国实验仪器公司）；Jade DSC型差示扫描量热仪（美国Perkin Elmer公司）；UV2450型紫外分光光度计（日本岛津）；BT25S型十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T型超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；SOP型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；85-2型数显恒温磁力搅拌器（江苏中大仪器科技有限公司）；LGJ-10型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；ZDHW型调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；WZJ-681型振动式药物超微粉碎机（济南倍力粉技术工程有限公司）；Five Eosy PlusTM FE20型pH计（METTLER TOLEDO）；TG16-WS型台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 试药 芹菜籽挥发油（实验室自制）；羟丙基-β-环糊精（山东滨州智源生物科技有限公司）；中性蛋白酶（江苏锐阳生物科技有限公司，200 000 U/g）；中温α淀粉酶（江苏锐阳生物科技有限公司，10000U/g）；丁苯酞对照品（批号101035-201502，中国食品药品检定研究院，含量以99．6%计）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；石油醚（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；去离子水（自制，优普系列超纯水器）。

2 方法与结果

2.1 芹菜籽挥发油的提取 取芹菜籽适量，超微粉碎机粉碎，过五号药典筛。然后取过筛后的芹菜籽粉300 g，置于圆底烧瓶中，加入1 800 mL去离子水浸泡30 min。加磷酸调节pH至6．2，加入6 g复合酶（中性蛋白酶：中温α淀粉酶=1∶1），混合均匀，置55℃水浴中酶解2 h，然后采用水蒸气蒸馏法提取5 h，即得淡黄色透明的芹菜籽挥发油，提取率为 2．336%。

2.2 包合物制备方法 精密称取芹菜籽挥发油适量于烧杯中，加适量的无水乙醇溶解；另取各实验对应的羟丙基-β-环糊精于烧杯中，加2倍量的水溶解。将羟丙基-β-环糊精溶液置于磁力搅拌器上，固定转速，在各实验对应的恒定温度下逐滴加入挥发油乙醇溶液，搅拌至规定时间，包合液以2 000 r/min的转速离心2 min后，吸去上层未包合的挥发油，用0．45μm孔径微孔滤膜过滤，放至冷冻干燥机，冷冻干燥24 h即得芹菜籽挥发油-羟丙基-β-环糊精包合物。

2.3 含量测定方法

2.3.1 色谱条件 高效液相色谱柱：Platisil C18（Dikma公司，4．6 mm×250 mm，5 μm），流动相-乙腈：0．3% 磷酸水（48∶52），流速：1 mL/min，检测波长：235 nm；柱温：25℃，进样量20μL，理论塔板数不低于2 500。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取丁苯酞对照品4．89 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到浓度为97．4μg/mL的对照品贮备液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取0．5 g包合物样品置于25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0．45 μm 孔径微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3.4 线性关系考察 分别取“2．3．2”项下对照品溶液适量，甲醇稀释，摇匀，得到浓度为9．740、19．48、38．96、58．44、77．92、97．40 μg/mL 的系列对照品溶液，用 0．45 μm 孔径微孔滤膜过滤，按“2．3．1”项下色谱条件进行测定。以进样浓度（X）对峰面积（Y）做标准曲线，得丁苯酞的回归方程分别为：Yˆ=34240X+11 521（r=0．999 8）。结果表明，丁苯酞在 9．740～97．40μg/mL的浓度范围内浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.3.5 精密度实验 精密吸取“2．3．2”项下对照品溶液，按上述色谱条件，进样20μL，重复进样6次，测定丁苯酞的峰面积，按峰面积计算RSD值为0．70%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性实验 取同一批样品6份，按“2．3．3”项下方法制备包合物的供试品溶液，按“2．3．1”项下色谱条件测定供试品溶液中丁苯酞的峰面积，计算RSD值为0．77%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.7 稳定性实验 取同一批包合物，按照“2．3．3”项下方法制备供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、10、12 h 进样，按“2．3．1”项下色谱条件测定供试品中溶液中丁苯酞的峰面积，计算RSD值为1．5%，表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.3.8 加样回收率 精密称取已知含量的样品6 份，精密加入一定量的对照品，按“2．3．1”项下色谱条件进行测定，根据峰面积计算平均回收率和RSD值。丁苯酞平均回收率为100．6%，RSD为1．7%（n=6），表明方法准确性良好。

2.4 评价指标 制备包合物的过程中的评价指标采用综合评分法，以包合率和包合物中丁苯酞的载药量为综合考察指标，按照“2．3．3”项下方法制备供试品溶液，采用高效液相色谱法测定包合物中丁苯酞的含量，以包合物中的丁苯酞总量与投入量的比值计算包合率Y1，权重系数0．7；以包合物中丁苯酞的单位含量作为载药量Y2，权重系数0．3。综合指标OD=（Y1/Y1max）×0．7+（Y2/Y2max）×0．3。

2.5 单因素考察

2.5.1 投料比单因素考察 精密称取芹菜籽挥发油5份，按照“2．2”项下包合物的制备方法，设定包合温度为40℃，包合时间为120 min，考察芹菜籽挥发油与羟丙基-β-环糊精的比例为 1∶50、1∶25、3∶50、2∶25、1∶10 时的包合率和载药量，并计算 OD 值。实验结果见表1，由结果可知投料比为2∶25时，包合物的OD值最大，比例增大，挥发油的包合率会减小，包合物的OD值随之减小，因此选用投料比2∶25为星点实验的中心点。

2.5.2 包合温度单因素考察 精密称取芹菜籽挥发油5份，按照“2．2”项下包合物的制备方法，设定挥发油与羟丙基-β-环糊精的比例为2∶25，包合时间 120 min，考察包合温度为 30、40、50、60、70 ℃时的包合率和载药量，并计算OD值。实验结果见表2，由结果可知包合温度为40℃时，包合物的OD值最大，温度升高或降低都不利于芹菜籽挥发油的包合，因此选用40℃为星点实验的中心点。

表1 投料比对包合效果的影响Tab.1 Effect of feeding ratio on inclusion

表2 包合温度对包合效果的影响Tab.2 Effect of inclusion tem perature on inclusion

2.5.3 包合时间单因素考察 精密称取芹菜籽挥发油5份，按照“2．2”项下包合物的制备方法，设定挥发油与羟丙基-β-环糊精的比例为2∶25，包合温度 40 ℃，考察包合时间为 40、80、120、160、200 min时的包合率和载药量，并计算OD值。实验结果见表3，由结果可知，包合时间为160 min时，包合物的OD值最大，包合时间增长会导致挥发油损失，包合率下降，因此选用160 min为星点实验的中心点。

表3 包合时间对包合效果的影响Tab.3 Effect of inclusion time on inclusion

2.6 星点设计效应面法优化 效应面优化法就是通过拟合效应变量对考察因素变量的效应面，即函数f可以用某一数学模型近似地模拟函数，依据该模型可以描绘效应面，从效应面上选择最优的效应域，利用这一数学模型求得自变量的取值范围即最佳实验条件的优化法[17]。

本实验通过单因素考察，确定了投料比、包合温度、包合时间的优化范围，采用三因素五水平的星点设计，以包合率和载药量的OD值为考察指标，对包合工艺进行优化，星点设计因素水平见表4、星点设计实验安排与结果见表5。

表4 星点设计因素水平表Tab.4 Level table of central com posite design

表5 星点设计实验安排与实验结果Tab.5 Experimental arrangement and results of central com posite design

运用Design expert 10．0．3软件对实验数据进行回归分析，以OD值对自变量进行多元线性回归和二项式、三项式非线性拟合，多元线性方程为：OD=83．007 26-2．497 8A+0．102 51B+3．936 56×10-3C（P=0．218 8，失拟项 P=0．001 2）；二项式拟合方程为：OD=26．813 53+630．33A+1．047 07B+0．180 93C-0．575AB-0．58437AC+2．8125×10-4BC-3227．04873A2-0．011 795 5B2-4．721 6×10-4C2（P＜0．000 1，失拟项P=0．316 6）；三项式拟合方程为：OD=-10．130 10+1 112．114 63A+2．834 77B+0．202 59C-22．793 52AB-1．01206AC+3．125×10-5BC-3468．08883A2-0．033760B2-4．421 60 ×10-4C2+3．125 ×10-3ABC-1．541 04A2B+1．891 76A2C+0．274 56AB2（P=0．000 5，失拟项 P=0．207 41）。二项式拟合模型 P＜0．000 1，说明其具有统计学意义，该模型在本研究所选定的因素范围内有统计学意义；方程的失拟项不显著说明模型与实际情况模拟较好，没有失拟因素存在，可以选用此模型对实验结果进行分析，二项式回归模型方差分析见表6。

表6 二项式回归模型方差分析表Tab.6 Analysisof variance for regression model

2.7 验证实验 根据Design expert 10．0．3软件对实验结果的分析，得到两两因素对包合效果OD值影响的三维效应曲面图（见图1）和等高线图（见图2），软件预测最佳包合工艺条件为：挥发油与羟丙基-β-环糊精比例为 2∶25，包合温度 44．5 ℃，包合时间167 min，在该包合条件下，综合评分（Y）的预测值为89．95，按上述优化结果的条件制备3批包合物，测定包合率和载药率，结果如表7所示。所得平均OD值为89．95，实际值与星点设计预测结果基本一致，说明该拟合方程可较好地预测实验结果，该包合工艺稳定可行。

2.8 包合物的表征

2.8.1 紫外扫描法（UV） 取芹菜籽挥发油10 mg，加25 mL无水乙醇溶解，为样品a；取包合物0．15 g，加25 mL乙酸乙酯，超声20 min，0．45μm孔径微孔滤膜滤过，续滤液为样品 b；取包合物0．15 g，加25 mL乙酸乙酯，振摇后0．45μm孔径微孔滤膜滤过，续滤液为样品 c；取羟丙基-β-环糊精 0．15 g，加25 mL无水乙醇溶解，为样品d。对4个样品进行紫外扫描，扫描范围200～400 nm。由图3结果可知，羟丙基-β-环糊精对测定无干扰，芹菜籽挥发油的乙醇溶液与包合物的乙酸乙酯提取液在273 nm和280 nm处有明显的吸收峰，而包合物的乙酸乙酯溶液在这两个波长下没有吸收峰，说明芹菜籽挥发油被羟丙基-β-环糊精成功包合。

2.8.2 差示扫描量热法（DSC） 采用差示扫描量热法对芹菜籽挥发油包合物进行表征，测定气体为氮气，升温速度为10℃/min，升温范围为30～450℃，以空白坩埚为参比，分别测定芹菜籽挥发油、羟丙基-β-环糊精、芹菜籽挥发油包合物、羟丙基-β-环糊精与芹菜籽挥发油混合物。由图5可知，混合物的热曲线呈现两者特征叠加，说明两者只是物理混合。芹菜籽挥发油包合物与羟丙基-β-环糊精的热曲线相似，呈现羟丙基-β-环糊精的特征，未有挥发油热曲线的特征，表明羟丙基-β-环糊精成功包合芹菜籽挥发油。

图1 各两两因素对OD值的三维效应曲面图的影响Fig.1 Effect of each two factors on 3D-response surface map of OD values

图2 各两两因素对OD值的等高线图的影响Fig.2 Effect of each two factors on contour map of OD values

图3 样品紫外吸收曲线Fig.3 UV absorption curveof samples

图4 样品差示扫描量热曲线Fig.4 Differential scanning calorimetry curve of samp les

表7 包合验证实验结果Tab.7 Results of inclusion verification test

3 讨论

目前，包合挥发油的材料主要有β-环糊精和羟丙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精是由β-环糊精和环氧丙烷缩合而成的一类羟烷基亲水性衍生物，与β-环糊精相比具有水溶性好、疏水性空腔大、安全性好等优点[18]。本研究曾采用β-环糊精对芹菜籽挥发油进行包合，但是包合率低且重现性差，β-环糊精水溶性差，不利于药物溶出。因此本研究采用羟丙基-β-环糊精包合芹菜籽挥发油，以包合率和载药量的OD值作为评价指标，根据重要程度分配权重，优化出最优工艺。

星点设计-效应面优化法比正交实验更简便，比均匀设计法更全面，其实验次数较少，实验精度高，适用于多因素、多水平的实验[19]。本实验通过单因素考察，确定出各因素的优化范围，采用星点设计-效应面法对芹菜籽挥发油包合工艺进行优化，通过二项式拟合方程预测实验结果。建立的HPLC方法适用于包合物中丁苯酞的含量测定，该方法操作简单，灵敏度高，专属性强，重现性好。

本实验通过星点设计-效应面法筛选出芹菜籽挥发油的最优包合工艺：采用饱和水溶液法，挥发油与羟丙基-β-环糊精比例为2∶25，包合温度44．2℃，包合时间166 min，在此包合条件下，羟丙基-β-环糊精包合芹菜籽挥发油的包合率为78．95%，载药量为 2．982 mg/g。采用 UV、DSC 对芹菜籽挥发油包合物进行表征，结果表明芹菜籽挥发油被羟丙基-β-环糊精成功包合。