基于综合评分法优选猪苓最佳炮制方法*

李丽红，刘丽婷，刘亚男，毛 睿，王 飘，窦志英

（天津中医药大学，天津 301617）

猪苓为多孔菌科真菌猪苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fries]的干燥菌核[1]，其菌核入药在中国已有2 000多年的历史，具有利水渗湿之功效[2]，临床上主要用于治疗小便不利、水肿、泄泻等症。其分布较广，以云南产量最大、陕西所产质量为优[3]。猪苓的生长发育一般要经过4个阶段，分别是担孢子、菌丝体、菌核和子实体[4]，在这期间猪苓主要依靠蜜环菌供给其生长所需要的营养物质[5]。猪苓的化学成分较多，其中多糖类成分是猪苓的重要活性成分，具有抗肿瘤、延缓衰老、保肝等作用[6-8]，甾体类成分是主要的利尿成分，此外还有氨基酸类、维生素类及微量无机元素等[9]。

合理的炮制方法不仅可以保证药材的质量，还能降低成本，提高效率以及减少药材的损耗[10]。猪苓采收后均需要在产地净选去除杂质后，再采用水处理软化至内外湿度均匀一致[11]，按照一定的规格切制成饮片，猪苓饮片可直接用于临床调配处方或作为供药制剂的原料。王天媛等[12]采用晒干、阴干、不同温度烘干共10种加工方法处理猪苓药材，结果发现不同加工方法处理的猪苓药材性状差异较小，有效成分含量存在显著性差异，40、50℃烘干处理时麦角甾醇和总多糖含量较高。鲁文静等[13]研究结果表明，50℃烘干法的多糖含量最高，阴干法多糖含量较低；自然晒干及70℃烘干所得麦角甾醇含量较高，而高温烘干得到的麦角甾醇含量较低。而到目前为止，对猪苓的浸润方法研究较少。本实验采用不同浸泡时间和不同干燥方法对猪苓药材进行加工处理，以猪苓中麦角甾醇、麦角甾酮、多糖和水溶性浸出物为评价指标，采用综合评分法优选猪苓的最佳炮制方法，为猪苓的炮制工艺及质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；色谱柱为phenomenon-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；UV6100S型紫外分光光度仪（上海美普达仪器有限公司）；KQ-300B超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；FA210电子分析天平（上海舜宇恒科学仪器有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（江苏金坛市科析仪器有限公司）；XMT-921A远红外恒温干燥箱（天津市华北实验仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（巩义市英峪高科仪器厂）。

1.2 材料 麦角甾酮对照品（天津蓝天翔宇科技有限公司，批号X27J8L38809）、麦角甾醇对照品（上海生工生物有限公司，批号A600443-0005）、D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号110833-201707）；蒽酮（天津索罗门生物科技有限公司）；95%乙醇（分析纯，天津渤化化学试剂有限公司）；浓硫酸（天津市化学试剂供销公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

猪苓药材来源于陕西省商洛市丹凤县，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为多孔菌科真菌猪苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fries]的干燥菌核，样品粉碎过4号筛。

2 实验方法

2.1 麦角甾醇和麦角甾酮含量测定

2.1.1 色谱条件色谱柱为phenomenon-C18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（95∶5）；检测波长麦角甾醇283 nm，麦角甾酮343 nm，体积流量1.0 mL/min；柱温：30℃。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取麦角甾醇和麦角甾酮对照品适量，加甲醇溶解，得浓度分别为0.400 mg/mL麦角甾醇、0.048 mg/mL麦角甾酮对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 取猪苓样品粉末（过4号筛）0.5 g，精密称定，置于100 mL具塞三角瓶中，加入甲醇10 mL，称质量，超声60 min，放至室温，加溶剂补足质量，混匀，滤过，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

2.1.4 方法学考察 线性关系：精密移取麦角甾醇、麦角甾酮对照品溶液适量，用甲醇稀释一系列浓度的对照品溶液，麦角甾醇浓度分别为0.400、0.200、0.100、0.050 0、0.025 0、0.0125、0.0 0600、0.003 00 mg/mL，麦角甾酮浓度分别为 0.048 0、0.024 0、0.012 0、0.006 0、0.003 0、0.001 5、0.000 80、0.000 40 mg/mL，进样量20 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程麦角甾醇为Y=34 283 478X+58 072，相关系数 r=0.999 3，线性范围：0.003～0.400 mg/mL。麦角甾酮为Y=44 843 619X+13 375，相关系数 r=0.999 1，线性范围：0.000 4～0.048 0 mg/mL。

精密度实验：取“2.1.2”项下混标溶液，在色谱条件“2.1.1”项下，连续进样6针，测定峰面积并计算RSD值。结果显示麦角甾醇和麦角甾酮RSD值分别为0.57%、1.04%，表明仪器精密度良好。

稳定性实验：取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件在 0、2、4、8、12、24 h 分别进样，记录峰面积并计算RSD值。结果麦角甾醇和麦角甾酮RSD值分别为1.54%，1.95%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性实验：精密称取同一个样品6份，按“2.1.3”提取处理方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，计算各对照品的质量分数，结果麦角甾醇和麦角甾酮RSD值分别为0.81%，0.69%，表明重复性良好。

加样回收率测定：精密称取9份已测定的猪苓粉末各约0.25g，分别加入麦角甾醇、麦角甾酮对照品溶液（相当于猪苓饮片中麦角甾醇、麦角甾酮的80%，100%，120%的含量），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，计算回收率及RSD值。结果麦角甾醇、麦角甾酮的加样回收率分别为99.93%、99.86%，RSD值分别为1.51%、1.78%。

2.2 多糖含量测定

2.2.1 硫酸-蒽酮试剂的配制及检测条件 取蒽酮0.2 g溶解于100 mL浓硫酸中，即得，当天配制使用。取1 mL多糖供试液至25 mL具塞试管中，冰水浴中缓慢滴入2.5 mL硫酸蒽酮，摇匀，置于沸水浴中加热10 min，取出，冰水浴冷却后，以蒸馏水做空白对照，626 nm下测得吸光度，并根据吸光度计算猪苓多糖含量。

2.2.2 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖标准品（105℃干燥至恒重）100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得1 mg/mL的葡萄糖对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取猪苓粉末约1.0 g，精密称定，置于250 mL锥形瓶中，向其加入80 mL 95%乙醇超声20 min，过滤，弃去滤液，回收滤渣，滤纸及滤渣挥干溶剂后放锥形瓶中，加水80 mL，超声提取20 min，过滤得滤液，转移定容至100 mL容量瓶中，取1 mL溶液稀释至10 mL容量瓶中即得多糖供试液。

2.2.4 方法学考察 标准曲线的绘制：精密吸取上述葡萄糖对照品储备液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，分别取1 mL置10 mL具塞试管中，各加入硫酸蒽酮溶液2.5 mL，混匀，置沸水浴中加热10 min，冰水浴中冷却降温，另取蒸馏水1.0 mL同上平行操作，作为空白溶液，在626 nm下测定吸光度。以吸光度为纵坐标（Y），以葡萄糖溶液浓度为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程Y=9.599 1X+0.069 3，r=0.998 4，线性范围 0～1.013 mg/mL。

精密度实验RSD值为0.290%，表明仪器精密度良好；重复性实验RSD值为1.83%，表明实验重复性良好；稳定性实验RSD值为1.98%，表明样品在2 h内稳定；加样回收率实验平均加样回收率为99.96%，RSD值为1.89%。

2.3 浸出物含量测定 水溶性浸出物测定：按2015年版《中华人民共和国药典》第四部附录2201水溶性浸出物测定方法（冷浸法）对样品进行测定，计算水溶性浸出物的量。

3 炮制工艺研究

3.1 优选最佳浸泡时间

3.1.1 最大吸水量考察 取相同规格的猪苓药材100 g，平行 3份，各加水 500 mL，浸泡 24 h，考察最大吸水量。结果24 h内最大吸水量为（130.00±2.00）mL。

3.1.2 吸水速率考察 取相同规格的猪苓药材100g，平行 3 份，各加水 500 mL，分别在浸泡 2、4、6、8、10、12、24 h时测定其吸水量，并计算吸水速率。结果见表1。

表1 不同浸泡时间吸水速率

吸水速率（mL/h）35.33±2.57 7.17±0.58 4.83±0.14 3.67±0.26 3.67±0.89 3.00±0.32 1.94±0.29浸泡时间（h） n 0～2 3 2～4 3 4～6 3 6～8 3 8～10 3 10～12 3 12～24 3

由表1可知，随着浸泡时间的延长，猪苓药材吸水速率逐渐减慢，0～2h吸水速率最快，为35.33mL/h，8 h前后吸水速率基本保持不变，说明猪苓药材在浸泡8 h基本达到饱和状态，且药材已达到润软可切的程度。

3.1.3 浸泡时间考察 取同一产地同一规格净制后的猪苓药材各100 g，分别加等量的水并用湿纱布覆盖于表面，分别浸泡 2、4、6、8、10、12、24 h，每组平行3份，切片，干燥。测定不同浸泡时间下猪苓中麦角甾醇、麦角甾酮、多糖和水溶性浸出物的含量，测定结果见表2。

3.1.4 采用综合评分法优选猪苓药材最佳浸泡时间 采用综合评分法来选择最佳浸泡时间，隶属度函数计算：F（x）=（x-x最小值）/（x最大值-x最小值）；综合分数=多糖隶属度×50%+麦角甾醇隶属度×30%+麦角甾酮隶属度×10%+水溶性浸出物隶属度×10%。结果见表2。

由表2可知，猪苓药材在浸泡2～8 h时间段内，麦角甾醇和麦角甾酮含量均有所增加，浸泡8 h时二者含量均达到最大值。其中浸泡2 h与4 h、4 h与6 h麦角甾醇无显著性差异（P＞0.05），浸泡8 h与浸泡时间＜8 h各组之间均存在极显著性差异（P＜0.01）。浸泡8 h之后，两者含量又有所降低。而多糖和水溶性浸出物含量随着浸泡时间的延长，都呈现先升高后下降的趋势，浸泡10 h达到最大值，其中，浸泡2～6 h之间各组均无显著性差异（P＞0.05），浸泡8 h与浸泡时间＜8 h各组之间有显著性差异。

由综合评分结果可知，浸泡8 h综合评分最高，其分值达到0.796，浸泡时间过短和过长综合评分值都较低，浸泡24 h综合评分分值仅为0.254，说明浸泡24 h有效成分损失较大。由此可得出猪苓药材不宜浸泡过长时间，最佳水浸泡时间为8 h。

3.2 干燥方法的优选 取同一批猪苓药材按上述优选的最佳浸泡时间浸泡8 h后，切片，分别采用烘干法（50℃、60℃、70℃、80℃烘干）、自然晾干法、冷冻干燥法、微波干燥法进行干燥，每组平行3份。

3.2.1 不同干燥方法对各指标含量的影响 测定不同干燥方法猪苓中麦角甾醇、麦角甾酮、多糖、水溶性浸出物的含量，研究不同干燥方法对其含量的影响。测定结果见表3。

表2 优选猪苓药材最佳浸泡时间的综合评分表

表3 优选猪苓最佳干燥方法的综合评分表

3.2.2 采用综合评分法优选猪苓最佳干燥方法 以麦角甾醇、麦角甾酮为指标，最佳干燥方法为自然晾干，其次是50℃烘干；以多糖为指标，最佳干燥方法为80℃烘干；以水溶性浸出物为指标，最佳干燥方法为60℃烘干。说明不同干燥方法对猪苓中的各成分含量有很大的影响，因此采用综合评分法优选最佳干燥方法。隶属度函数计算公式见“3.1.4”，计算结果见表3。

结果表明，不同干燥方法对各成分含量有显著影响，自然晾干下麦角甾醇、麦角甾酮含量最高，其次为50℃烘干。不同干燥方法中麦角甾醇含量大小顺序为：自然晾干＞50℃烘干>70℃烘干>60℃烘干＞冷冻干燥>80℃烘干>微波干燥，其中，50℃烘干麦角甾醇含量显著高于80℃烘干，而与自然晾干无显著性差异（P>0.05）。麦角甾酮含量大小顺序为：自然晾干＞50℃烘干>60℃烘干>70℃烘干＞微波干燥>冷冻干燥>80℃烘干，各组之间均有显著性差异（P＜0.05）。多糖含量大小顺序为：80℃烘干>冷冻干燥＞自然晾干＞70℃烘干＞微波干燥>50℃烘干＞60℃烘干。其中，50℃烘干与60℃、70℃烘干无显著性差异，与80℃烘干有显著性差异（P＜0.05）。浸出物含量大小顺序为：60℃烘干＞80℃烘干＞50℃烘干＞70℃烘干＞冷冻干燥＞微波干燥>自然晾干。其中，60℃烘干与各组之间均有显著性差异。

由综合评分结果可知，干燥方法中自然晾干的综合评分最高，其分值达0.745，其次是冷冻干燥，其分值为0.674，50℃烘干，其分值为0.631，评分最低的为微波干燥，分值为0.242。由于自然晾干时间较长，且受天气影响；冷冻干燥成本较高，操作繁琐，且耗时长，不能广泛采用。所以，选择50℃烘干作为猪苓干燥加工方法较为合适，适用于大规模生产。由此表明，综合评分法是一种比较合理的评估药材质量的一种简单可靠的方法。

4 讨论

中药材的水处理是一个重要环节，掌握正确的水处理方法，可以提高药材有效成分的利用率[14-16]。但是目前仍存在着中药材浸润工艺不规范和不合理的操作，特别是将药材长时间浸泡在水中，会致使其有效成分大量流失，甚则发霉腐烂，严重影响药材饮片或中成药的内在质量甚或产生毒性物质。2015年版《中华人民共和国药典》规定，猪苓药材的炮制方法为洗净，浸泡，润透，切片，但对于具体的浸泡时间没有规定，各省市炮制规范中对猪苓药材的浸润方法也不尽相同，而且到目前为止，有关猪苓浸润及干燥工艺的研究较少，因此本研究考察了猪苓药材浸泡时间及干燥方法，通过综合评分法优选最佳浸泡时间及干燥方法。

结果表明，浸泡8 h综合评分分值最高，达到0.796，且药材软化程度较好，切出的饮片较美观，同时有效成分含量较高。干燥方法中，自然晾干法综合评分最高，达0.745，但对于大规模集中生产来说，这种方法既不能提高生产效率又不易达到药材的卫生要求，且受天气影响比较大。而烘干法时间短，且温度好控制，适合大规模生产。烘干法中50℃烘干综合评分值最大，因此综合考虑采用50℃烘干较为合适。该干燥方法的优选为猪苓的大规模生产及质量控制提供参考。