淫羊藿药材的UPLC指纹图谱研究*

尹艳微，贾 琪，马文娟，欧阳慧子，常艳旭，何 俊

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 301617；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿（Epimedium brevicomuMaxim.）、箭叶淫羊藿[Epimediumsagittatum（Sieb.Et Zucc.）Maxim.]、柔毛淫羊藿（Epimedium pubescens Maxim.） 或朝鲜淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai）的干燥叶[1]。具有补肾阳，强筋骨，祛风湿功效[1-3]。其主要化学成分为黄酮类、木质素类等化合物[4-5]，其中黄酮类化合物为其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗心肌缺血和强筋骨等的作用。现代研究表明，淫羊藿具有抗骨质疏松，免疫调节与延缓衰老等药理作用[6-8]，临床多用于治疗骨质疏松症、高血压、血液病等疾病。作为传统的补益类中药，淫羊藿药材具有较高的临床药用价值，中国淫羊藿物种资源丰富，应对其进行合理、充分的开发和利用。但是淫羊藿药材种类多、分布广，受产地、气候、生态环境等因素影响，其所含化合物种类及含量差异较大，质量和疗效都不可控，严重影响了淫羊藿药材的临床使用。因此，需要建立快速、可靠的分析检测方法，以便能够更加全面、系统的评价淫羊藿药材的质量。

中药指纹图谱是将某种中药材或中成药经过适当处理后，采用一定的分析手段，提取其化学信息并加以描述，得到能够标志该中药材或中成药特性的共有峰的图谱[9]。其显著特点是整体性强、信息量丰富、特征性强。建立中药指纹图谱分析方法有许多种，包括色谱指纹图谱、光谱指纹图谱等。中药指纹图谱根据图谱的整体信息，对中药质量做出整体评价，其目的在于反映中药多成分特点，整体控制中药质量，确保中药内在质量的均一、稳定[10]。根据指纹图谱技术要求，针对淫羊藿药材成分复杂、含量差异大及质量参差不齐的现状，本研究以湖北、吉林、四川、甘肃等12个不同批次的淫羊藿药材建立淫羊藿的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，为淫羊藿药材的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有在线脱气机、四元泵、恒温自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（DAD）；AX 205型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水制备仪（Millipore公司）；3K15型高速离心机（美国Sigma公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 试药 对照品宝藿苷I（批号：AB201B）、朝藿定 A（批号：AP770E）、朝藿定 B（批号：AW850E）、朝藿定 C（批号：AP775E）、木兰花碱（批号：AP102M）、淫羊藿苷（批号：AB070I）均购自天津一方科技有限公司。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购自美国Fisher公司，甲酸（色谱纯）购自美国ROE公司。

淫羊藿分别采自于吉林、湖北、甘肃、陕西、四川、辽宁等地，淫羊藿基源由天津中医药大学王晖老师鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：CORTECS®C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相：A 相 0.1% 甲酸水，B 相乙腈；梯度洗脱，洗脱梯度为：0～4 min，5%～20%B；4～5 min，20%～25%B；5～10 min，25%～25%B；10～11 min，25%～40%B；11～17 min，40%～48%B；17～18 min，48%～5%B，流速为 0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：1 μL；检测波长 270 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取木兰花碱、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I对照品各5.00 mg，加甲醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL的储备液，4℃冰箱储存备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 分别精密称取不同批次淫羊藿粗粉（过60目筛）50.0 mg，加70%乙醇定容至5 mL，超声提取1 h，加70%乙醇补足失重，取上清液经0.45 μm有机微孔滤膜过滤即得，4℃冰箱储存备用。不同批次淫羊藿的产地及基源见表1。

表1 不同批次淫羊藿的产地及基源

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 精密称取淫羊藿样品5（湖北）50.0 mg，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按上述的色谱条件连续进样6次，进样量为1 μL，测得各共有色谱峰相对保留时间及峰面积，计算其RSD值，结果见表2，表明精密度良好。

表2 淫羊藿指纹图谱的精密度、稳定性、重复性结果（n=6）

2.3.2 重复性实验 精密称取淫羊藿样品5（湖北）6份，每份50.0 mg，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，进样量为1 μL，记录共有成分保留时间及峰面积，计算其RSD值，结果见表2，表明重复性较好。

2.3.3 稳定性实验 精密称取淫羊藿样品5（湖北）50.0 mg，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样 1 μL，记录共有成分保留时间及峰面积，考察室温条件下样品的稳定性，计算其RSD值，结果见表2，表明供试品溶液24 h内稳定。2.4 指纹图谱的建立及相似度分析 分别取12个不同批次的淫羊藿药材，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件分别测定，得到不同批次的淫羊藿药材UPLC指纹图谱。使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2.0版，国家药典委员会，2010）对12个不同批次淫羊藿药材的实验数据进行分析，以标准指纹图谱为参照色谱图，得到12批淫羊藿药材特征图谱见图1。由图1可知，这12批不同批次淫羊藿药材有21个共有峰，其中有6个已知峰，依次为木兰花碱、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷I。相似度分析结果见表3。

图1 12批淫羊藿药材UPLC指纹图谱

表3 相似度分析结果

3 讨论

淫羊藿作为传统中药材并被广泛使用，其成分复杂，含有黄酮类、木质素类、生物碱类、甾体类等多种化学成分。王丽霞等[11]采用反相液相色谱（RPLC）法，对秦岭山区产4种淫羊藿药材进行指纹图谱研究，并采用LC/MS法标定了朝藿定AI、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷五种化合物。陈婷等[12]采用高效液相色谱（HPLC）法，对同一批次朝鲜淫羊藿药材样品进行测定，建立朝鲜淫羊藿HPLC指纹图谱，标定了4个特征峰，分别为淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C。本研究在前期研究的基础上，建立了淫羊藿药材UPLC指纹图谱，得到不同产地各批次淫羊藿药材与标准指纹图谱相似度均在0.911以上。图谱中有21个共有峰，标定了6个化合物，分别为淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、木兰花碱和宝藿苷I，可更加全面、快速的对淫羊藿药材进行质量控制，为今后开展淫羊藿药材谱效学研究，使其质量和药效结合奠定了基础。