miR-337靶向调节p53表达对结肠癌细胞自噬和迁移能力的影响*

李 磊， 张 秘， 李文涛， 张代娟， 刘江月△

(潍坊医学院 1解剖学教研室, 2附属医院， 3机能学实验室， 4病理生理教研室， 山东 潍坊 261053)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是发病率和死亡率最高的消化系统恶性肿瘤之一。近年来，CRC的发病率和死亡率持续增高，发病年龄逐渐年轻化，且预后差[1-2],因此深入研究结肠癌的发病机制对提高结肠癌的早期诊断及改善预后非常重要。自噬是细胞内物质代谢的一条重要途径，自噬活性的异常与肿瘤的发生发展、侵袭和转移等密切相关，已成为近年来肿瘤发生机制、治疗和预后研究的新领域[3]。Beclin-1是参与自噬调节的关键分子，LC3B是用来检测和监测细胞自噬过程应用最广泛的标志物[4]，p53蛋白是近些年新发现的能够抑制细胞自噬作用的蛋白。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类物种间序列高度保守的单链非编码小RNA，几乎参与了细胞增殖、分化和凋亡等各种生命活动，对肿瘤发生、发展具有重要的调控作用[5-6]。本研究通过检测结肠癌组织中beclin-1、LC3B和p53蛋白的表达，分析自噬与临床特征的相关性；通过生物信息学预测、筛选靶向p53的miRNAs，检测其对p53基因的调控作用，并分析其对结肠癌细胞自噬和侵袭转移的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1组织标本 收集2016年1月～2017年12月潍坊医学院附属医院病理科保存的59例手术切除的经活检证实为结肠癌且术前未经任何放、化疗治疗的组织标本,其中男38例，女21例；年龄48～79(61.5±3.8)岁；低分化22例，中高分化37例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期34例；肠壁浸润深度T1～T2 24例，T3～T4 35例；有远处淋巴结转移26例，无远处淋巴结转移33例。取距离肿瘤位置>5 cm的癌旁黏膜组织标本作为对照。所有组织标本均采用4%的多聚甲醛固定保存。

1.2细胞株 人结肠癌细胞株HCT116购自中国科学院上海细胞库。

1.3主要试剂及仪器 免疫组化和Western blot相关试剂(碧云天生物技术研究所)；细胞培养相关试剂(Gibco)；抗beclin-1、LC3B和p53 I抗(武汉博士德生物工程有限公司)；双萤光素酶检测试剂盒(Promega)。SpectraMax Gemini EM 荧光型酶标仪(Molecular Devices)；DYCZ-25D型电泳仪(北京市六一仪器厂)；Bio-Rad 型湿转仪和BioSpectrum AC凝胶成像分析系统(Bio-Rad)。

2 方法

2.1免疫组化检测beclin-1、LC3B和p53蛋白的表达 固定的标本常规石蜡包埋，4 μm连续切片，常规HE染色，明确病理诊断。采用免疫组化 SP 法检测结肠癌组织和正常黏膜组织中的beclin-1、LC3B和p53蛋白的表达，操作步骤按说明书进行，PBS代替 I 抗作阴性对照。结果判定：beclin-1、LC3B和p53均以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞, 使用同机图像分析系统，进行免疫组化分析，另有一位经验丰富的病理医师进行光镜下分析。根据阳性细胞的百分比判断：无阳性着色或阳性着色<5%记为0分，阳性着色5%～25%记为1分，着色细胞25%～50%记为2分，着色细胞>50%记为3分；根据颗粒着色强度进行判断：不染色记为0分，颗粒浅棕色记为1分，颗粒棕色记为2分，颗粒深棕色记为3分;两者乘积0分为阴性，1～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～9分为强阳性(+++)。阳性率(%)=(弱阳性例数+阳性例数+强阳性例数)/总例数×100%。

2.2透射电镜观察结肠癌细胞株HCT116细胞中自噬小体的形成 常规培养的HCT116细胞分为正常对照(control)组和p53基因敲减(p53 siRNA)组(转染p53基因的siRNA以敲减p53基因的表达水平)。收集细胞，用3%戊二醛固定过夜，1%锇酸固定2 h，脱水，纯包埋液37 ℃包埋2～3 h，固化，超薄切片机切片70 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察细胞内自噬小体。

2.3Western blot检测HCT116细胞beclin-1和LC3B蛋白的表达 细胞处理同电镜实验，提取总蛋白，SDS-PAGE后切取目的条带进行转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入 I 抗(1∶500)4 ℃过夜，TBST漂洗3次，II 抗孵育1 h，化学发光反应，显影定影，图像分析。

2.4萤光素酶报告基因检测 常规培养的HCT116细胞分别以miRNA-NC+psiCHECK-2 vector、miRNA-NC+psiCHECK-2-p53 3’-UTR、miR-337+psiCHECK-2 vector及miR-337+psiCHECK-2-p53 3’-UTR进行转染，48 h后利用萤光素酶报告实验试剂盒进行检测，具体操作按说明书进行，检测miR-337对p53基因3’-UTR相互作用的位点和功能。

2.5RT-qPCR方法检测miR-337在HCT116细胞中的表达 常规培养的HCT116细胞分为正常对照(control)组和过表达miR-337组(过表达miR-337的慢病毒转染)，收集细胞，提取总RNA后合成cDNA，GAPDH为内参照，进行RT-qPCR反应。

2.6Western blot检测p53、beclin-1和LC3B的表达 细胞处理同RT-qPCR实验，收集细胞，提取总蛋白，检测p53、beclin-1和LC3B的表达，方法同上。

2.7Transwell实验检测HCT116细胞的迁移能力 细胞处理同RT-qPCR实验，将生长良好的HCT116细胞调整密度为5×108/L。取100 μL细胞悬液加入Transwell小室上室中，下室加入600 μL含20% FBS的培养基。培养24 h后，拿出小室，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS 漂洗3次，去除滤膜上层细胞后，镜下观察细胞迁移情况并拍照。

3 统计学处理

应用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。计数资料采用2检验；两指标相关性采用Spearman秩检验；计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 结肠癌组织中beclin-1和LC3B蛋白的表达及与临床病理特征的关系

结肠癌组织中beclin-1和LC3B蛋白的阳性表达率分别为27.1%和32.2%，癌旁黏膜组织中分别为91.5%和86.4%，结肠癌组织中beclin-1和LC3B 蛋白阳性表达率低于癌旁黏膜组织(P<0.05)，见图1、表1。低分化、Ⅲ+Ⅳ期、肠壁浸润深度T3～T4及有远处淋巴结转移结肠癌组织中beclin-1和LC3B 阳性表达率低于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、肠壁浸润深度T1～T2及无远处淋巴结转移结肠癌组织(P<0.05)，结肠癌组织中beclin-1和LC3B 阳性表达率与性别和年龄无关(P>0.05)，提示结肠癌组织中自噬活性减弱，与结肠癌的发生发展及预后密切相关，见表2。

Figure 1. The protein expression of beclin-1 and LC3B in adjacent colonic mucosa and colon cancer tissues (×200).

图1 Beclin-1和LC3B蛋白在癌旁黏膜组织和结肠癌组织中的表达

表1 Beclin-1和LC3B蛋白在结肠癌和癌旁黏膜组织中表达的比较

2 结肠癌组织中p53蛋白的表达及与beclin-1和LC3B蛋白的关系

结肠癌组织中p53蛋白阳性表达率为72.9%，显著高于癌旁黏膜组织(20.3%)(P<0.05),见图2。p53蛋白的表达与beclin-1和LC3B蛋白的表达呈负相关(r=-0.828，r=-0.771，P<0.05)，提示p53蛋白负调节自噬活性。

3 敲减p53基因的表达对HCT116细胞中自噬小体形成的影响

转染靶向p53基因的siRNA敲减p53基因表达后，HCT116细胞中自噬小体形成明显增多,见图3。

4 敲减p53基因的表达对HCT116细胞中beclin-1和LC3B蛋白表达的影响

转染靶向p53基因的siRNA敲减p53基因表达后，细胞自噬相关蛋白beclin-1和LC3B表达明显升高(P<0.05)，证实p53基因能够负调节自噬活性，见图4。

5 miR-337在HCT116细胞中的表达

我们通过TargetScan软件预测，发现p53基因有miR-337的结合位点，miR-337在p53基因mRNA的3’-UTR的作用位点预测见表3。RT-qPCR检测到miR-337在HCT116细胞中有表达，见图5。

表2 结肠癌组织中beclin-1和LC3B蛋白表达与临床病理特征的关系

Figure 2. The expression of p53 protein in adjacent colonic mucosa and colon cancer tissues (×200).

图2 p53蛋白在癌旁黏膜和结肠癌组织中的表达

Figure 3. The effect ofp53gene expression knock-down on autophagosome formation in the HCT116 cells (×8 000).

图3 敲减p53基因的表达对HCT116细胞中自噬小体形成的影响

Figure 4. The protein expression of beclin-1 and LC3B in the HCT116 cells with knock-down ofp53gene expression. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

图4 敲减p53基因的表达对HCT116细胞中beclin-1和LC3B蛋白表达的影响

6 miR-337对p53基因的靶向调节作用

通过萤光素酶报告实验来验证 miR-337靶向调节p53基因的情况，与miRNA-NC+psiCHECK-2 vector共转染的细胞相比，miR-337+psiCHECK-2 vector

表3 TargetScan预测miR-337靶向结合p53基因3’-UTR的结合位点

Table 3. TargetScan predicted the binding site of miR-337 on the 3’-UTR ofp53gene 共转染的细胞，其萤光素酶表达活性没有变化，而在miR-337+psiCHECK-2-p53 3’-UTR共转染的细胞，萤光素酶表达活性显著降低(P<0.05)，见图6。

Predicted consequen-tial pairing of target region and miRNASeed matchp53 3’-UTR3’-ggucgauuguuAUGUGACGGc-5’ miR-3375’-acaaccaauuuUACACUGCCu-3’

Figure 5. The expression of miR-337 in the HCT116 cells.

图5 miR-337在HCT116细胞中的表达

Figure 6. Luciferase reporter assay of miR-337/miRNA-NC+psiCHECK-2-p53 3’-UTR/psiCHECK-2 vector in colon cancer HCT116 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsmiR-337+psiCHECK-2 vector group.

图6 萤光素酶报告基因实验结果

7 过表达miR-337对HCT116细胞p53、beclin-1和LC3B蛋白表达的影响

用过表达miR-337的慢病毒转染HCT116细胞，p53蛋白表达明显下调，自噬相关蛋白beclin-1和LC3B表达明显升高(P<0.05)，见图7。

Figure 7. The effect of miR-337 over-expression on the protein expression of p53, beclin-1 and LC3B in the HCT116 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

图7 过表达miR-337对HCT116细胞p53、beclin-1和LC3B蛋白表达的影响

8 过表达miR-337对HCT116细胞迁移能力的影响

用过表达miR-337的慢病毒转染HCT116细胞，迁移至下室的细胞数量较对照组显著减少(P<0.05)，见图8。

讨 论

结肠癌是我国发病率逐年升高的恶性肿瘤之一,男女发病比率约为1.4～2.5∶1[7]，本研究中，入组的标本男女比率大约为1.8，符合流性病学发病特点。随着医学的不断进步，对结肠癌的发生、发展及预后的研究也更加深入，但其发生机制目前尚不明确。

目前研究发现，多种恶性肿瘤中均存在自噬活性的改变，且与肿瘤的发生、发展密切相关。研究发现，beclin-1和LC3B蛋白在宫颈鳞癌组织、乳腺癌组织及肺癌组织中的表达均显著低于相应正常组织中的表达[8-10]，本研究结果显示结肠癌组织中beclin-1和LC3B 蛋白阳性表达率显著低于癌旁正常黏膜组织，提示结肠癌组织中自噬活性减弱，与前人的研究结果一致。自噬活性减弱可能导致内环境稳态失衡，利于细胞突变和肿瘤细胞的发生，同时在肿瘤生长早期，肿瘤细胞的迅速大量繁殖需要蛋白合成，而自噬的作用是降解蛋白，所以自噬活性降低利于肿瘤生长。肿瘤的分化程度、TNM分期、浸润深度及淋巴结转移等临床病理特征与患者病情进展密切相关，是评价患者预后的重要指标，分化越低、TNM 分期越晚、浸润深度越深及有远处淋巴结转移的患者，病情进展快，预后差。本研究结果提示beclin-1和LC3B 蛋白在低分化、Ⅲ+Ⅳ期、肠壁浸润深度T3～T4及有远处淋巴结转移结肠癌组织中阳性表达率明显低于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、肠壁浸润深度T1～T2及无远处淋巴结转移结肠癌组织中的阳性表达率，在肝癌、食管鳞癌和胃癌组织中beclin-1和LC3B蛋白阳性表达率与临床病理资料的研究中也得到与本研究一致的结果[11-13]，证明细胞自噬参与了结肠癌的发生、发展过程，beclin-1和LC3B蛋白可用来监测肿瘤的发展以及患者的预后，可作为早期评估患者病情的重要指标。

Figure 8. The effect of miR-337 over-expression on the migration ability of HCT116 cells (×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

图8 过表达miR-337对HCT116细胞迁移能力的影响

Green等[14]研究发现胞质p53能够通过负性调节自噬活性参与肿瘤的发生发展。本研究结果显示p53蛋白的表达与beclin-1和LC3B蛋白的表达呈负相关，敲减p53基因的表达水平后，细胞自噬相关蛋白beclin-1和LC3B表达明显升高，从而证实了p53基因能够负调节自噬活性，与前人的研究结果一致。p53 可通过AMPK途径抑制mTOR 的活性，后者是抑制自噬的关键调节分子之一，从而增强自噬[15]，为CRC的发生发展提供有利条件。Lorin等[16]研究表明p53能够激活JNK，活化的JNK通过磷酸化Bcl-2蛋白而解除Bcl-2和beclin-1所形成的复合物的结合或上调DRAM表达，使细胞自噬发生。孔娜[17]证明了JNK/Bcl-2磷酸化介导的保护性自噬是HCT116 p53-/-和HT29细胞侵袭转移的可能分子机制。本研究进一步发现miR-337能够下调HCT116细胞p53基因的表达，促进结肠癌的自噬进程，并能抑制结肠癌细胞的迁移，从而延缓或阻止结肠癌的发生、发展进程。

总之，本研究证实细胞自噬参与了结肠癌的发生、发展过程，并发现miR-337可能通过靶向调节抑制p53表达促进结肠癌细胞自噬。这为结肠癌的防治提供新的靶点。