柿蒂中齐墩果酸、熊果酸微波辅助提取工艺的优化

郑丹丹，李福帅，张 超，张立华，吕 慧，王占一，王京龙∗

（1.枣庄学院，山东 枣庄 277160；2.山东中医药大学，山东 济南 250355）

前期报道，超声辅助提取技术被广泛用于柿蒂中齐墩果酸、熊果酸的提取［3，9］；微波辅助萃取技术具有操作简单、用时短、提取率高等优点，作为新技术也在中药活性成分提取中得到了成功应用［10-11］，但尚无提取上述2 种成分的报道。因此，本实验对柿蒂中齐墩果酸、熊果酸的微波辅助提取工艺进行优化，旨在为后续研究及工业化生产提供理论依据，也为相关资源开发提供借鉴。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；XH-200A 电脑微波固液相合成／萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；UV-4802 双光束紫外-可见分光光度计 ［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；MF-1000 小型薄膜旋转蒸发器（山东爱博科技贸易有限公司）。柿蒂购自枣庄市天天好医药连锁有限公司，经枣庄学院李思健教授鉴定为柿树科植物柿Diospyros kakiThunb.的干燥宿萼。熊果酸（批号20160810，含有量≥98%）、齐墩果酸（批号20180320，含有量≥98%）对照品（上海如吉生物科技有限公司）。冰乙酸、乙酸铵为分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司）；高氯酸为分析纯（天津市鑫源化工有限公司）；香草醛为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）；甲醇、乙腈为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 总三萜含有量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称定取熊果酸对照品适量，甲醇稀释并定容至100 mL，即得（0.1 mg／mL）。

2.1.2 供试品溶液制备［12］取适量药材粗粉（过40 目筛）置于索式提取器中，石油醚（60～90 ℃）脱脂1.5 h，取出晾干，称取5 g，按一定料液比加入适量提取剂，置于微波合成萃取仪中，调节适当的微波参数进行提取，结束后过滤，滤液转移至100 mL 量瓶中，将洗涤容器和残渣的乙醇滤液合并，少量乙醇定容至刻度，摇匀，即得（0.05 g／mL）。

2.1.3 吸光度测定 精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液0.50 mL，置于10 mL 具塞试管中，60 ℃水浴蒸干，精密加入新配制的5% 香草醛-冰醋酸0.30 mL、高氯酸1.00 mL，60 ℃水浴15 min，移入冰水浴中冷却至室温，再加入5.00 mL 冰醋酸摇匀，15 min 后于548 nm 波长处测定吸光度。

2.1.4 方法学考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，按“2.1.3”项下方法测定，以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A=47.837X+0.004 4（R2=0.999 0），在0.004 76～0.012 7 mg／mL 范围内线性关系良好。另外，仪器精密度RSD 为0.8%；重复性RSD 为1.69%；反应后2 h 内稳定性良好，RSD 为2.0%；平均加样回收率为103.60%，RSD 为2.8%。综上所述，方法学验证符合相关要求。

2.2 齐墩果酸、熊果酸含有量测定

花芽被害后，严重者花蕾不能开放，萎缩枯死。轻者被害花萼片和花梗畸形，花瓣狭长，色淡绿，在花萼洼或梗洼处产生白色粉斑。受害花的雌、雄蕊失去作用，不能授粉坐果，最后干枯死亡。

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取齐墩果酸、熊果酸对照品适量，甲醇稀释并定容至50 mL，即得（0.1、0.2 mg／mL）。

2.2.2 供试品溶液制备 取“2.1.2”项下供试品溶液适量，过0.45 μm 微孔滤膜，即得（0.05 g／mL）。

2.2.3 色谱条件 Hypersil ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.2% 乙酸铵（85∶ 15）；体积流量0.6 mL／min；柱温25 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL，色谱图见图1。理论塔板数按各成分色谱峰计均大于8 000，分离度均大于1.7。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4 方法学考察 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，定容至10 mL，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得齐墩果酸、熊果酸方程分别为Y=16 740X+93.767（R2=0.999 8）、Y=16 248X-40.8（R2=0.999 6），分别在0.01～0.06、0.02～0.12 mg／mL 范围内线性关系良好。齐墩果酸精密度RSD 为1.25%；重复性RSD 为1.6%；16 h 内稳定性良好，RSD 为1.6%；平均加样回收率为99.75%，RSD 为1.28%，而熊果酸精密度RSD 为0.96%；重复性RSD 为1.7%；16 h 内稳定性良好，RSD 为1.2%；平均加样回收率为101.5%，RSD 为0.98%。综上所述，方法学验证符合相关要求。

2.3 单因素试验

2.3.1 料液比 取脱脂后药材粉末5 g，固定乙醇体积分数70%，微波功率650 W，微波时间6 min，按“2.1.3”项下方法测得料液比1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36 下总三萜得率分别为0.37%、0.44%、0.48%、0.43%、0.39%。由此可知，该成分得率随着料液比增大呈先上升后下降趋势，在1∶28时最高，而在1∶20、1∶36 时较小，故选择1∶24、1∶28、1∶32 进行响应面试验。

2.3.2 乙醇体积分数 取脱脂后药材粉末5 g，固定料液比1∶20，微波功率650 W，微波时间6 min，按“2.1.3”项下方法测得乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90% 下总三萜得率分别为0.35%、0.45%、0.46%、0.43%、0.40%。由此可知，该成分得率随着乙醇体积分数增大呈先上升后下降趋势，在60%、70%、80%时较高，其中70%时最高，故选择60%、70%、80%进行响应面试验。

2.3.3 微波时间 取脱脂后药材粉末5 g，固定料液比1∶20，微波功率650 W，乙醇体积分数70%，按“2.1.3”项下方法测得微波时间4、5、6、7、8 min 下总三萜得率分别为0.37%、0.45%、0.46%、0.44%、0.38%。由此可知，该成分得率随着微波时间延长呈先上升后下降趋势，在5、6、7 min 时较高，其中7 min 时最高，故选择5、6、7 min进行响应面试验。

2.3.4 微波功率 取脱脂后药材粉末5 g，固定料液比1∶20，微波时间6 min，乙醇体积分数70%，按“2.1.3”项下方法测得微波功率450、550、650、750、850 W 下总三萜得率分别为0.33%、0.39%、0.47%、0.37%、0.34%。由此可知，该成分得率随着微波功率增大呈先上升后下降趋势，在450 W 时较低，升至850 W 时又明显下降，故选择550、650、750 W 进行响应面试验。

2.4 Box-Behnken 响应面法优化 在单因素试验基础上，以料液比（A）、乙醇体积分数（B）、微波时间（C）、微波功率（D）为影响因素，齐墩果酸得率（Y1）、熊果酸得率（Y2）为评价指标，通过Design Expert V.8.0.6 软件设计四因素三水平试验，因素水平见表1［11］，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

然后，通过Design-Expert V.8.0.6 软件对表2数据进行拟合，得回归方程分别为Y1=0.16+5.833×10-3A-0014B+0.010C+0.025D+0.020AC+0.026BC+0.018CD-0.071A2-0.032B2-0.018C2-0.030D2、Y2=0.36-4.167×10-4A-0.017B+0.014C+0.029D-1.250×10-3AB+0.029AC-5.250×10-3AD+0.025BC+2.000 ×10-3BD+0.021CD-0.087A2-0.038B2-0.024C2-0.037D2。

齐墩果酸得率方差分析见表3，可知回归模型高度显著（F=13.79，P＜0.000 1），失拟项P=0.123 8 ＞0.05，表明模型拟合度较好；D、BC、A2、B2、D2有极显著影响（P＜0.01），B、AC、C2有显著影响（P＜0.05），各因素影响程度依次为D＞B＞C＞A。熊果酸得率方差分析见表4，可知回归模型高度显著（F=20.93，P＜0.000 1），失拟项P=0.091 1 ＞0.05，表明模型拟合度较好；B、C、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2有极显著影响（P＜0.01），CD 有显著影响（P＜0.05），各因素影响程度依次为D＞B＞C＞A。响应面分析见图2～3。

表3 齐墩果酸得率方差分析Tab.3 Analysis of variance for oleanolic acid yield

表4 熊果酸得率方差分析Tab.4 Analysis of variance for ursolic acid yield

图2 各因素响应面图（齐墩果酸得率）Fig.2 Response surface plots for various factors（oleanolic acid yield）

2.5 验证试验 通过Design-Expert V.8.0.6 软件进行分析，得到齐墩果酸最优提取工艺为料液比1∶28.37，乙醇体积分数71.65%，微波时间6.78 min，微波功率713.29 W，得率0.167%；熊果酸最优提取工艺为料液比1∶28，乙醇体积分数69.80%，微波时间6.56 min，微波功率700 W，得率0.369%，可知2 种成分工艺参数非常接近，考虑到可操作性，将两者统一调整为料液比1∶28，乙醇体积分数70%，微波时间6.5 min，微波功率700 W。然后，取脱脂后药材粉末5 g，按照优化工艺进行3 次验证试验，结果见表5，可知工艺稳定可行。

3 讨论

微波辅助提取法能大大提高效率，由常规的1～2 h 降低到6～7 min，可为齐墩果酸、熊果酸提取工艺优化降低成本。本实验发现，各因素对成分得率的影响程度依次为微波功率＞乙醇体积分数＞微波时间＞料液比。

表5 验证试验结果（n=3）Tab.5 Results of verification tests（n=3）

由于齐墩果酸和熊果酸为一对同分异构体，化学性质相近，故两者最优提取工艺也非常相似，可高效地同时提取两者。同时，HPLC 分析时在流动相中加入0.2% 乙酸铵［13］，可起到反相离子对作用，从而改善上述2 种成分的分离效果［14］，并且其理论塔板数均大于8 000，分离度达到1.7，符合含有量测定要求。2015 年版《中国药典》中柿蒂尚无药效成分定量控制的规定，而本方法简便可行，可为相关方法的建立提供借鉴。

图3 各因素响应面图（熊果酸得率）Fig.3 Response surface plots for various factors（ursolic acid yield）